抗體偶聯(lián)標(biāo)記生物素/熒光/辣根過氧化物酶/磁珠/瓊脂糖珠

抗體偶聯(lián)標(biāo)記，是以共價偶聯(lián)的方式將標(biāo)記基團連接在抗體上的一種標(biāo)記技術(shù)。

若偶聯(lián)在抗體上的基團是熒光染料、熒光蛋白等標(biāo)記物，偶聯(lián)后的抗體可以用來做流式細胞術(shù) FACS 、IF、活體成像等標(biāo)記示蹤類實驗。若被偶聯(lián)在抗體上的是 HRP、AP 等酶類，偶聯(lián)后的抗體可以直接跟檢測底物反應(yīng)，用于 ELISA、WB、IHC 等試驗檢測。若被偶聯(lián)的基團是 Biotin，偶聯(lián)的抗體可以再同酶聯(lián)親和素或酶聯(lián) Anti-Biotin 抗體反應(yīng)，若抗體直接被偶聯(lián)在磁珠、瓊脂糖珠等固相介質(zhì)上；或通過抗體生物素化，再與鏈霉親和素介質(zhì)結(jié)合后，則能用于靶蛋白復(fù)合物親和純化，及其蛋白相互作用研究中。

西安pg電子官方生物提供定制抗體偶聯(lián)標(biāo)記物，主要提供以下四大類

1.抗體偶聯(lián)標(biāo)記熒光染料、熒光蛋白。

2.抗體偶聯(lián)標(biāo)記HRP、AP 等酶類。

3.抗體偶聯(lián)標(biāo)記Biotin生物素。

4.抗體偶聯(lián)標(biāo)記磁珠、瓊脂糖珠等固相介質(zhì)上。

抗體是怎么被生物素，熒光，辣根過氧化物酶，磁珠，瓊脂糖珠偶聯(lián)標(biāo)記上的？抗體偶聯(lián)標(biāo)記中的共價化學(xué)鍵是如何形成？以下內(nèi)容為你解答:

抗體偶聯(lián)標(biāo)記相比于抗體標(biāo)記，多了 “偶聯(lián)（conjugation）” 一詞，指抗體和標(biāo)記基團之間是通過共價鍵連接而成�？贵w的標(biāo)記除了共價標(biāo)記之外，也可以通過非共價的親和作用力來標(biāo)記，

 那么抗體偶聯(lián)標(biāo)記中的共價化學(xué)鍵是如何形成的呢？跟其他化學(xué)反應(yīng)類似，共價鍵是兩個底物在合適的條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)得到�？贵w這個大分子蛋白上常用的反應(yīng)基團包括：氨基、巰基和羧基（圖 1）。

在能夠跟以上基團起反應(yīng)的活性反應(yīng)物上修飾標(biāo)記基團，完成偶聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過純化后的產(chǎn)物即是偶聯(lián)標(biāo)記好的抗體。在活性反應(yīng)物中，常見是對抗體氨基反應(yīng)的 NHS 酯（N-hydroxysuccinimide esters，N-琥珀酰亞胺基酯）和針對抗體巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺（Maleimides）。這兩個標(biāo)記反應(yīng)的化學(xué)原理可以參考下面的示意圖（圖 2）。

NHS 酯的標(biāo)記反應(yīng)一般在弱堿性的無伯胺緩沖液（如硫酸鹽、碳酸鹽、硼酸鹽緩沖液）中進行，然后用含伯胺緩沖液（如 Tris 鹽，Glycine 緩沖液等）中止反應(yīng)。NHS 酯極易水解，隨著 pH 升高水解反應(yīng)越劇烈。NHS 的水溶液在 pH 7.0 的 0°C下，半衰期僅 4-5 小時；pH 8.6 的 4°C下，半衰期降為 10 分鐘。NHS 酯的水解會對其氨基標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)生競爭**，使標(biāo)記效率嚴(yán)重下降。因此一般 NHS 類標(biāo)記試劑都是現(xiàn)配現(xiàn)用，且在保存時需要格外注意避免潮解。對于抗體標(biāo)記的新手而言，建議選用小包裝分裝好的試劑進行反應(yīng)。

馬來酰亞胺是標(biāo)記巰基的常用試劑。但抗體或其他蛋白中的二硫鍵通常會使得半胱氨酸殘基中的巰基并不暴露在外。所以巰基標(biāo)記關(guān)鍵的一步就是得到暴露在外的可以跟馬來酰亞胺反應(yīng)的巰基。抗體自身的重鏈和輕鏈就是通過二硫鍵共價交聯(lián)在一起的，因此對抗體做巰基標(biāo)記需要格外小心——即要部分打開重鏈之間的二硫鍵，又不能夠破壞重鏈和輕鏈之間的二硫鍵，以免過分影響其抗原結(jié)合的效果。在通過計算還原劑和抗體使用比例達到合適的還原后，跟 NHS 酯的標(biāo)記反應(yīng)類似，標(biāo)記反應(yīng)液中還需要去除外源的硫醇干擾（常用還原劑多會含有硫醇），因此需要對還原后的抗體進行脫鹽或透析。此外，在馬來酰亞胺反應(yīng)液中一般還需要加入金屬螯合劑 EDTA，以免其氧化巰基影響實驗。

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