在蛋白質(zhì)骨架上進(jìn)行翻譯后位點(diǎn)選擇性的氘代標(biāo)記

氫原子的同位素經(jīng)常被用來進(jìn)行標(biāo)記蛋白質(zhì)來進(jìn)行蛋白的功能、結(jié)構(gòu)和機(jī)制，然而目前將同位素標(biāo)記在蛋白上主要是利用分段標(biāo)記的策略，即利用同位素標(biāo)記的氨基酸后在進(jìn)行傳統(tǒng)的肽段合成。這個(gè)方法往往會導(dǎo)致標(biāo)記的某個(gè)氨基酸的標(biāo)記缺乏位點(diǎn)的選擇性，而且需要復(fù)雜的工程表達(dá)體系。目前還沒有可以直接進(jìn)行位點(diǎn)選擇性在整個(gè)蛋白水平上進(jìn)行氘代標(biāo)記的策略。受到烯醇化合物的親核加成反應(yīng)的啟發(fā)，推測可以在氨基酸和蛋白水平上生成α，β不飽和的酰胺，隨后與重水（D2O）反應(yīng)，從而引入氘代標(biāo)記。

脫氫丙氨酸（Dha）是一種存在的氨基酸，它可以通過半胱氨酸（Cys）衍生生成。因此認(rèn)為蛋白中的Cys轉(zhuǎn)化為Dha后，Dha中的α，β不飽和的酰胺捕獲重水中親電D+，隨后再與硫醇化合物發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)位點(diǎn)選擇性的無痕氘代標(biāo)記。為了使Dha與硫醇化合物S-R反應(yīng)能夠得到Cys的產(chǎn)物，測試了R=H, Ac和PO32-等時(shí)化合物的反應(yīng)活性和脫保護(hù)情況, 發(fā)現(xiàn)磷酸化的硫醇化合物均能成功地反應(yīng)插入和脫保護(hù)。先在組蛋白H3的10號Cys位點(diǎn)H3-Cys10進(jìn)行驗(yàn)證，利用雙烷基化的脫除試劑DBHDA將Cys轉(zhuǎn)化為Dha，隨后H3-Hda10在重水環(huán)境下與Na3SPO3反應(yīng)生成H3-[d1]Cys10–S–PO32-，分別可以通過磷酸酶PP1或酸環(huán)境脫除磷酸根，得到H3-[d1]Cys10, 其中酶水解1 h后的產(chǎn)率>95%。得到的產(chǎn)物在α位置存在差向異構(gòu)，其中L:D的比例在1:2。也同樣在H3的26號Cys位點(diǎn)H3-Cys26進(jìn)行了同樣的反應(yīng)，也實(shí)現(xiàn)了位點(diǎn)選擇性的氘代標(biāo)記。

之前開發(fā)的DBHDA試劑可以選擇性在蛋白中的Cys進(jìn)行脫除反應(yīng)生成Dha，然而其中的機(jī)制卻不清楚，進(jìn)一步利用這種氘代標(biāo)記研究了Cys轉(zhuǎn)化為Dha中的蛋白化學(xué)反應(yīng)機(jī)理。先探究了與蛋白中的Cys反應(yīng)生成的硫葉立德反應(yīng)中間體的穩(wěn)定性以及對隨后的C-H交換反應(yīng)活性的影響。發(fā)現(xiàn)中間體發(fā)生消除反應(yīng)生成的Dha的過程中硫葉立德的生成和相應(yīng)位點(diǎn)的脫除是密切相關(guān)的。還通過密度泛函理論對DBHDA將Cys轉(zhuǎn)化為Dha過程的可能的過渡態(tài)能量進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)了在消除反應(yīng)過程中硫葉立德中間體可能存在Swern-like分子內(nèi)脫質(zhì)子過程。

來源：本文來源網(wǎng)絡(luò)，版權(quán)歸相關(guān)權(quán)利人所有，如侵權(quán)，請聯(lián)系刪除.