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外泌體是40-180 nm大小的細胞外囊泡，由各種類型的細胞廣泛分泌，包括細胞，免疫細胞，干細胞和內皮細胞等。它們在長距離和短距離的細胞間通信中起著至關重要的作用。有研究在來源的外泌體膜中發(fā)現了各種特定的表面粘附分子，它們介導了對同源細胞的靶向，同時外泌體膜上高表達的CD47蛋白可以幫助外泌體逃脫巨噬細胞的吞噬作用。據我們所知，此前還沒有外泌體膜包被仿生納米顆粒靶向清除CTCs并轉移的報道。外泌體膜修飾的策略可以幫助納米粒子規(guī)避巨噬細胞的吞噬作用，并靶向原發(fā)，識別CTCs。

外泌體膜包載仿生前藥納米系統(tǒng)的制備與表征

通過單硫醚鍵將亞油酸與PTX偶聯(lián)來制備ROS敏感的PTX前藥（圖1）。使用乳液溶劑蒸發(fā)法將PTX-S-LA和CuB共裝載到PEG-PCL納米粒子中，以制備PCNP，其中P表示PTX-S-LA，C表示CuB。然后將PCNP與EM孵育以獲取EMPC。相同的處理方法制備分別裝載有PTX-S-LA或CuB的EMP或EMC。下圖2顯示了PCNP的流體動力學直徑和形態(tài)，它們具有規(guī)則的球形形狀，平均大小接近80 nm。PTX-S-LA和CuB在PEG-PCL納米顆粒中的載藥量分別為9 wt％和5 wt％，包封率分別為87.6％和69.2％。

使用梯度離心法提取外泌體。通過透射電子顯微鏡（TEM）成像探究外泌體的碟狀結構，以及針對特征性外泌體標記物TSG101，CD9和CD81的蛋白質印跡分析，表明外泌體已成功分離。EMPC是通過對提取的外泌體進行低滲處理來制備的。將PEG-PCL納米顆粒與EM進一步孵育以制備EMPC。通過降低的zeta電位，增加的粒徑（?100 nm）和TEM圖像證明PEG-PCL納米顆粒表面上EM的成功包被。

為了檢查仿生外泌體納米顆粒殼上膜蛋白的存在，按以前的報道進行了十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質印跡試驗。膜蛋白標記的SDS-PAGE蛋白檢查表明，在仿生外泌體納米顆粒的蛋白質譜中，保留了從EM繼承的獨特蛋白。CD44和CD47對于轉移至關重要。CD44是MDA-MB-231細胞上的表面粘附分子，在CTC與轉移灶的粘附中起關鍵作用。CD47可以保護細胞免受巨噬細胞的吞噬作用，吞噬作用與的侵襲有關。如圖2D所示，它們共存于**細胞膜和EM上，并在EMPC中保存良好，以介導同型**細胞靶向。

然后，用DiI（紅色）標記EM，并用香豆素6（C-6，綠色）標記疏水核心，以檢查EM完全覆蓋PEG-PCL納米顆粒。將雙標記的納米顆粒添加到MDA-MB-231細胞中2 h，并用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察。如圖2E所示，DiI的熒光與C-6的熒光共定位，表明外泌體仿生納米顆粒在細胞攝取一段時間后可以保留結構完整性。

接下來，我們研究了C-6標記的PEG-PCL納米顆粒（C-6 NPs），C-6標記的紅細胞膜包被的PEG-PCL納米顆粒（RM @ C-6 NPs）和C-6標記的在MDA-MB-231，MCF-7和NIH 3T3細胞中包被外泌體的納米顆粒（EM @ C-6 NPs），以確認外泌體仿生納米顆粒的同型**細胞靶向能力。進行了紅細胞膜對PEG-PCL納米粒子的修飾，以驗證EM上的蛋白質在促進MDA-MB-231細胞內在化方面的關鍵作用。如圖3A所示，C-6 NPs和RM @ C-6 NPs的C-6熒光比EM @ C-6 NPs的熒光低，這表明細胞攝取的提高歸因于外泌體上的蛋白質。同時，將MCF-7和NIH 3T3細胞設為陰性對照，這進一步說明，用EM修飾納米顆�？商貏e增強同一來源**細胞的內在化。然后用流式細胞儀檢測靶向作用的定量。如圖3B所示，在MDA-MB-231細胞中，EM @ C-6 NP的熒光信號比C-6 NP和RM @ C-6 NP的熒光信號高3.5倍。相比之下，與C-6 NP和RM @ C-6 NP相比，EM @ C-6 NP在MCF-7和3T3細胞中未顯示熒光增強。以上提到的所有結果表明，仿生外泌體納米顆粒對同型**細胞具有選擇性親和力。

然后，驗證了外泌體上的CD47對巨噬細胞吞噬能力的作用。將接種于12孔板的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞與C-6 NP，RM @ C-6 NP和EM @ C-6 NP孵育。如圖4C所示，RM @ C-6 NP和EM @ C-6 NPs表現出比C-6 NPs低得多的內在化。對于流式細胞儀定量分析，與RM @ C-6 NP和EM @ C-6 NP相比，C-6 NP的熒光強度增加了3.1倍。結果證實，RM和EM上的CD47均可巨噬細胞的吞噬作用。

結論：

將ROS敏感的單硫醚鍵連接的紫杉醇-亞油酸前藥（PTX-S-LA）和葫蘆素B共同封裝到PEG-PCL聚合物中制得雙載藥膠束，并進一步用細胞衍生的外泌體膜修飾，制備外泌體樣序貫活化仿生前藥納米平臺。該制劑不僅地靶向原發(fā)，而且特異性捕獲清除CTCs，從而**了轉移。細胞攝取后，納米粒將**釋放出葫蘆素B，從而通過FAK / MMP信號通路調節(jié)**阻斷**細胞的粘附，遷移和侵襲并轉移。同時，釋放的葫蘆素B增加了細胞中的ROS水平，級聯(lián)促進了PTX-S-LA前藥的活化，起到一石二鳥的作用。該制劑表現出了出色的CTCs靶向能力、增強的前藥活化、延長的體內循環(huán)時間、更多的蓄積和更深的瘤內滲透，在原位和異位MDA-MB-231模型中均表現出出色的原發(fā)性和抗轉移活性。