3D打印技術(shù)結(jié)合創(chuàng)新生物墨水材料，為打印出的細(xì)胞或組織提供更接近體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，可應(yīng)用于再生醫(yī)療和組織工程中心臟、皮膚、軟骨、骨骼等組織構(gòu)建；以及體外檢測(cè)模型構(gòu)建，來進(jìn)行**代謝和篩選、化妝品檢測(cè)、生物材料研發(fā)和干細(xì)胞的體外分化等研究。

在組織工程領(lǐng)域，傳統(tǒng)制備方法如粒子瀝濾法和冷凍干燥雖然能夠制備多孔支架，但是難以**調(diào)控支架外型與內(nèi)部結(jié)構(gòu)。三維打印是一種增材制造方法，三維生物打印實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞或生長(zhǎng)因子和生物材料同時(shí)構(gòu)建三維支架，能夠控制細(xì)胞或生長(zhǎng)因子等在三維支架內(nèi)部的分布，有望**地在體外打印組織或器官。在此基礎(chǔ)上，三維打印主要是缺乏合適的生物材料用來構(gòu)建功能化生物墨水。

海藻酸鹽是線性聚陰離子型多糖，來源廣泛且價(jià)格低廉，主要結(jié)構(gòu)單元為β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G），由于海藻酸具有**的打印性能和與鈣離子快速交聯(lián)成型性能，同時(shí)較好的生物相容性有利于包載細(xì)胞，海藻酸鹽是生物墨水常用的材料之一。與鈣離子快速結(jié)合是海藻酸鹽的優(yōu)點(diǎn)但其也存在不足，鈣離子在生理環(huán)境下容易與其他單價(jià)離子發(fā)生置換，從而破壞了支架的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致支架坍塌。海藻酸鹽雖然具有較好的生物相容性，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的包裹和較高的存活率，但是海藻酸鹽的生物活性較低，細(xì)胞難以在海藻酸鹽上黏附和鋪展，限制了海藻酸鹽在三維生物打印中的應(yīng)用。目前的研究對(duì)于改善海藻酸鹽穩(wěn)定性問題，主要有對(duì)海藻酸鹽進(jìn)行甲基丙烯酸改性或接枝多巴胺，從而實(shí)現(xiàn)光交聯(lián)或氧化交聯(lián)；而為了提高海藻酸鹽的生物活性，接枝RGD蛋白序列是目前常用的方法之一，RGD能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附和鋪展。

設(shè)計(jì)了電荷可調(diào)控的海藻酸鹽/聚賴氨酸生物墨水，聚賴氨酸富含氨基，能夠與海藻酸鹽的羧基發(fā)生電荷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚電解質(zhì)之間的電荷相互作用能夠提高生物墨水的打印穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)大尺寸支架打印。另一方面，支架表面的電荷可調(diào)控性促進(jìn)了細(xì)胞的黏附并實(shí)現(xiàn)了活性因子的負(fù)載和緩釋，提高了海藻酸鹽的生物活性，實(shí)現(xiàn)了功能化支架打印。

三維生物打印圖示：

圖1 A：生物墨水組成和功能化支架打印示意圖；B：打印后支架在水中的穩(wěn)定性表征；C：打印的大尺寸自支撐結(jié)構(gòu)支架；D1，D2：打印的管狀支架正面圖和側(cè)面圖；D3：生物墨水搭載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活死染色和細(xì)胞存活率表征。

使用聚賴氨酸與海藻酸鹽混合，制備了聚電解質(zhì)生物墨水（圖1A），流變學(xué)表征證明小分子聚賴氨酸的加入并沒有改變海藻酸鹽基生物墨水的剪切稀化屬性，而打印后聚賴氨酸和海藻酸鹽之間的電荷相互作用提高了打印支架的穩(wěn)定性（圖1B）并且實(shí)現(xiàn)了大尺寸三維支架打�。▓D1C）。同時(shí)，他們嘗試了使用該生物墨水打印管狀支架（圖1D）并包載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞在生物墨水中的存活率較高。結(jié)果表明：基于電荷相互作用能夠提高生物墨水的穩(wěn)定性從而構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大尺寸三維支架。

三維支架理化性能表征：

打印后的支架經(jīng)過交聯(lián)處理能夠進(jìn)一步提高穩(wěn)定性，如圖2A，2B所示，海藻酸鹽/聚賴氨酸支架相對(duì)海藻酸鈣支架具有更高的含水量和孔隙率以及更緩慢的降解速率，而控制生物墨水的組分比例能夠進(jìn)一步調(diào)控降解速率。同時(shí)交聯(lián)處理后能夠調(diào)控支架的表面電荷和親疏水性（圖3A，3B），有利于生長(zhǎng)因子的靜電吸附，從而提高支架的功能性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明可調(diào)控的支架電荷能夠?qū)崿F(xiàn)硫酸軟骨素和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的負(fù)載和緩慢釋放（圖4）。

聚賴氨酸的添加改變了打印后支架的表面電荷，他們?cè)诖蛴『蟮闹Ъ鼙砻娣N植了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明聚賴氨酸改性的支架在表面帶正電荷的情況下能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附和鋪展，細(xì)胞的黏附量與海藻酸鈣支架有**性差異（圖5）。隨后他們研究了負(fù)載硫酸軟骨素或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的支架是否具備應(yīng)有的生物活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明固定的硫酸軟骨素促進(jìn)了干細(xì)胞成軟骨基因的表達(dá)以及促進(jìn)了二型膠原的大量分泌。而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩慢釋放促進(jìn)了干細(xì)胞血管分化相關(guān)基因的表達(dá)（圖6）。

由于電荷相互作用，海藻酸鹽/聚賴氨酸生物墨水能夠?qū)崿F(xiàn)在常態(tài)下大尺寸自支撐結(jié)構(gòu)三維支架的打印，而且支架在水溶液中具有很好的穩(wěn)定性，包載細(xì)胞的存活率較高。進(jìn)一步對(duì)支架進(jìn)行交聯(lián)，能夠?qū)崿F(xiàn)支架表面電荷可調(diào)控性，由于未使用鈣離子作為交聯(lián)劑，提高了支架長(zhǎng)期的穩(wěn)定性�；�于可調(diào)控的支架表面電荷，實(shí)現(xiàn)了促進(jìn)細(xì)胞黏附和固定各種生長(zhǎng)因子或細(xì)胞外基質(zhì)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了固定的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于干細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控作用。研究者相信，使用海藻酸鹽/聚賴氨酸生物墨水有利于實(shí)現(xiàn)大尺寸高穩(wěn)定性的三維支架個(gè)性化打印，而且支架的可調(diào)控的電荷和降解性能有望將其應(yīng)用于各種生長(zhǎng)因子與細(xì)胞外基質(zhì)的固定，賦予支架生物功能，從而滿足不同組織的修復(fù)需求。