在酶困定化研究中載體對(duì)底物和產(chǎn)物的吸附會(huì)造成載體內(nèi)部和載體周?chē)�底物和產(chǎn)物的濃度不均-，從而使固相酶活力的測(cè)定受到影響;同時(shí)，吸附現(xiàn)象也會(huì)改變酶的Km值，這種吸附在用微球載體固定化酶時(shí)尤為突出，本文用胺化聚苯乙烯微球載體固定生物素化堿性磷酸酶時(shí)載體的吸附現(xiàn)象及其對(duì)酶活力和酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值的影響.

實(shí)驗(yàn)部分

1、交聯(lián)聚苯乙烯乳膠懶球的制備及功能基化

2、生物素化堿性磷酸酶的制備

3、生物紊化堿性磷酸酶的固定化

4、載酶赦球?qū)Ξa(chǎn)物和底物的吸附

5、酶活力及動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值的測(cè)定 堿性磷酸酶的活力單位為37 ℃下 1 min 催化水解l umol對(duì)硝基苯磷酸所需的酶量.

酶活力在DEA緩沖液(含15 mmol/L 對(duì)硝基苯磷酸)中測(cè)定，用2 mol/L NaOH的DEA緩沖液終止反應(yīng).

固相酶活力測(cè)定;以含有滅活的固定化酶微球的不同濃度的對(duì)硝基苯酚溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線.Km值依v-'~[S]-‘雙倒數(shù)動(dòng)力學(xué)曲線求得.

結(jié)果與討論

在含一定濃度的對(duì)硝基苯磷酸(pNPP)及不同濃度的對(duì)硝基苯酚(pNP)的 DEA緩沖液中，測(cè)定了不同吸附時(shí)間下405 nm的光吸收值、從測(cè)得的p.NP濃度與光吸收值曲線(圖1)看出:在含0. 6 mmol/L底物的DEA緩沖液中,微球?qū)Ξa(chǎn)物pNP在15 min內(nèi)的吸附影響比在高濃度底物(15mmol/L>溶液中大得多、所得曲線嚴(yán)重漂移、已不呈直線．這說(shuō)明微球?qū)?/span>pNPP和pNP都有吸附作用．在測(cè)定固相酶的活力時(shí)需考慮底物濃度對(duì)光吸收曲線的影響．當(dāng)加入底物pNPP的濃度為15 mmol/L時(shí)(遠(yuǎn)大于加入產(chǎn)物pNP的含量),滅活的載酶胺化微球?qū)?/span>pNP仍有明顯的吸附作用．而且在一定時(shí)間內(nèi)隨吸附時(shí)間的延長(zhǎng),吸附量加大.

從圖1中看出，隨著吸附時(shí)間延長(zhǎng)曲線的線性關(guān)系發(fā)生變化,吸附2h后在含pNP濃度較低的溶液中微球仍有一定的吸附力;而在濃度較高的溶液中吸附已接近飽和,表現(xiàn)為與吸附45 min 的曲線重臺(tái),由此可見(jiàn)微球?qū)?/span>pNP的吸附有個(gè)**值.

吸附時(shí)間對(duì)微球吸附pNP和pNPP也有影響．從圖2看出，盡管吸附水平不同，但在溶液中不加底物pNPP與加入0.6 mmol/L和15 mmol/L pNPP的3種條件下，吸附曲線都在吸附15 min時(shí)接近飽和。吸附2h基本飽和.

微球?qū)?/span>pNPP和pNP吸附作用的原因:一個(gè)是由于固載堿性磷酸酶所用胺化聚苯乙鐸微球?yàn)榻宦?lián)型﹐酶分子通過(guò)戊二醛與做球表面的氨基交聯(lián)，微球內(nèi)部的大部分氮基在堿性溶液中形成NHOH-形式，具有一定的離子交換能力，帶負(fù)電性小分子pNPP 和 pNP通過(guò)異性電荷吸引及離子交換促進(jìn)吸附﹔另一個(gè)是胺化苯乙烯微球的疏水骨架與含苯環(huán)的產(chǎn)物和底物之間具有一定的疏水力，也促進(jìn)了吸附.

載體對(duì)底物和產(chǎn)物的吸附導(dǎo)致堿性磷酸酶固定化后米氏常數(shù)減小(圖3)，這是因?yàn)槲⑶蜉d體對(duì)底物的吸附能力影響了底物的分配效應(yīng)1．分配效應(yīng)以分配系數(shù)(p)來(lái)描述:p=S./S(式中S;和S分別表示底物在微環(huán)境中的局部濃度和客觀體系中的總體濃度).

在消除了外擴(kuò)散限制的影響后,分配效應(yīng)影響改變了固相酶的的Km值(K'm一Km/p).

本文研究的載體和底物帶相反電荷，p>1，從原理上講固定化酶的K'm小于游離酶Km實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了上述推斷．靜電作用使微環(huán)境中底物濃度比總體濃度高，Km減小，酶催化反應(yīng)的速度加快﹔另外，底物和載體間的疏水作用也會(huì)改變分散系數(shù)，使酶促反應(yīng)加快.

載酶微球的吸附效應(yīng)對(duì)酶催化反應(yīng)也有負(fù)作用，這表現(xiàn)在產(chǎn)物積累影響催化反應(yīng)上.在微球表面的酶分子催化底物pNPP轉(zhuǎn)化為pNP后，pNP積累于酶分子周?chē)�，如果不能及時(shí)擴(kuò)散，可能造成產(chǎn)物的竟?fàn)幮?*(．因?yàn)檩d酶微球?qū)Φ孜锖彤a(chǎn)物具有吸附瑰象，會(huì)造成標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線的漂移，所以在固相酶活力測(cè)定時(shí)要考慮這種現(xiàn)象對(duì)實(shí)際活力的影響．此外，載酶微球的底物和產(chǎn)物的吸附現(xiàn)象有利于固相酶在免疫檢測(cè)等顯色反應(yīng)中的應(yīng)用.

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部分產(chǎn)品列表

5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷    

5-溴-6-氯-3-吲哚基-beta-D-半乳糖苷    

1-甲基-3-吲哚基-BETA-D-吡喃半乳糖苷    

5-溴-4-氯-3-吲哚基-Β-D-葡萄糖醛酸鈉鹽    

5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽    

6-氯-3-吲哚基-D-葡糖醛環(huán)己基銨鹽    

5-溴-6-氯-3-吲哚基-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽    

4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸    

Firefly Luciferase Assay Kit    

Firefly & Renilla Dual Luciferase Assay Kit    

Coelenterazine f    

Coelenterazine cp    

Coelenterazine 400a (DeepBlueC)    

腔腸素    

腔腸素-H    

Methyl Coelenterazine    

Z-FR-R110    

Z-FR-AMC    

Z-AAD-R110    

Z-AA-R110-PEG    

Rhodamine 110 (high purity)    

R110-PEG (Rhodamine 110-PEG)    

zl 2021.02.22