1、氨基修飾介孔二氧化硅(NH2-MSN)的制備

  依據(jù)** Stober法制備MSN,在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)改良了** Stober 法，并一步合成NH2-MSN :1.0 g CTAB溶解于480 mL超純水中,加入3.5 mL 2 mol.L-1NaOH 溶液,80℃恒溫?cái)嚢?/span>2 h，然后快速加入3 mL TEOS,30 min后緩慢恒速滴入2mL APTES,控制5 min 滴畢,恒溫繼續(xù)反應(yīng)2 h,反應(yīng)結(jié)束后靜置熟化24 h, 15 000 r - min-1離心30min得到白色固體。將離心得到的白色固體分散于200 mL NH4NO3(10 mg .mL-')的乙醇溶液中80 ℃回流4 h,經(jīng)過(guò)6次反復(fù)操作去除模板劑CTAB,最后一次離心后真空干燥,得到白色粉末NH,-MSN。采用透射電鏡(TEM)分別對(duì)MSN、NH2-MSN進(jìn)行觀察，粒徑儀測(cè)定粒徑及Zeta 電位,傅立葉紅外光譜儀(FTIR)表征. NH2-MSN 上的修飾氨基。

2、NH2-MSN-RES的制備

  本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了反復(fù)飽和溶液吸附法來(lái)制備NH2 -MSN-RES:稱(chēng)取100 mg NH2-MSN(記為W10)分散到RES飽和乙醇溶液20 mL中,常溫25℃避光攪拌,每隔30 min短時(shí)超聲3 min,攪拌2h使 NH2-MSN充分吸附RES飽和乙醇溶液,然后15 000 r ·min-1離心30 min,將離心得到的白色固體35℃減壓干燥后稱(chēng)重(記為W11)﹐然后重復(fù)分散、吸附﹑離心、干燥、稱(chēng)重,每重復(fù)一次的稱(chēng)重分別記為W12、W13、W14……。同樣,稱(chēng)取100 mg NH2-MSN分散到乙醇溶液20 mL中,除了不加入RES 外,其他同法操作,每次稱(chēng)重分別記為W01、W02 、 W03、 W04……,按照相同的方法制備對(duì)照組MSN-RES。

3、NH2-MSN-RES體外釋放度的測(cè)定

  稱(chēng)取RES、MSN-RES、NH2-MSN-RES適量(折合RES量10 mg)分散于10 mL的PBS(pH 7.4)緩沖液﹐置于透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3500）中,透析夾密封后置于釋放介質(zhì)PBS 中,體積為1000 mL，在37℃下以50 r  min-1恒溫水浴振蕩,平行操作3份。分別于15、30、45、60 min、2、4、6、8、12、24、48 h取l mL透析介質(zhì),并補(bǔ)充相應(yīng)的PBS。取出的透析介質(zhì)用0.45 um微孔濾膜過(guò)濾,續(xù)濾液經(jīng) HPLC 測(cè)定RES濃度,計(jì)算累積釋藥百分率。

4、HPLC色譜條件

  色譜柱:SunFire C18 (4.6 mm x 250 mm,5 um);流動(dòng)相:甲醇水(50:50);柱溫:35℃;流速:1.0 mL·min-1 ;檢測(cè)波長(zhǎng):306 nm;進(jìn)樣量:20 uL。以白藜蘆醇的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),其濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得回歸方程為:y=132 917X +776.27,r =0.999 9,表明RES在0.25 ~10 ug· mL-'內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。考察其高、中、低3種濃度溶液的日內(nèi)精密度RSD小于2%,日間精密度 RSD小于3%。

5、NH2-MSN 細(xì)胞毒性

  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caco-2細(xì)胞接種于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中,密度為1 x105個(gè)·mL-1每孔加入190uL培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。然后實(shí)驗(yàn)組分別加入不同溶度的MSN和NH2-MSN的混懸液10 uL,**質(zhì)量濃度分別為0.01、0. 1、0.5、1、5、20、50、100 ug mL-1,空白對(duì)照組加入無(wú)菌生理鹽水,每組每濃度設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng) 24 h后，每孔加入 5 mg ·mL-1的MTT溶液10 uL,微量振蕩器上振蕩3 ~5min,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,加入DMSO 150 uL,在微量振蕩器上振蕩10 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處其光密度(A)值。取6個(gè)孔平均A值計(jì)算細(xì)胞的存活率(IC),IC=(實(shí)驗(yàn)組A 值/空白對(duì)照組A值)×**。

6、NH2-MSN-RES跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)

  參考文獻(xiàn)建立 Caco-2細(xì)胞單層模型。將造模成功的Transwell(美國(guó)Corning公司3402型,膜面積1.12 cm2,膜孔徑3 um)小室置于12孔嵌套板中，每板分為3 組 ( RES、MSN-RES、NH2-MSN-RES),平行6孔,每組考察含RES為2 ug ·mL-1 3種制劑的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。用預(yù)先37℃保溫的D-Hanks溶液沖洗3次,跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)AP側(cè)→BL側(cè)時(shí),在 BL室加入1.5 mL空白D-Hanks溶液,使AP室外表面完全浸透,然后在AP室加入1.5 mL含藥培養(yǎng)基;跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)BL側(cè)→AP側(cè)時(shí),在BL室中加入1.5 mL含藥培養(yǎng)基，AP室加入1.5 mL空白D-Hanks溶液。加入藥液后分別于0.5、1、2、4、8、12 h 時(shí)從BL或AP室小心取樣0.15 mL,并補(bǔ)充0.15 mL的空白D-Hanks。樣品經(jīng) HPLC測(cè)定**濃度,繪制**吸收曲線(xiàn)并計(jì)算表觀滲透系數(shù)Papp，Papp =△Q/(△t· A·P0),△Q為**的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量( ug) ;△Q/At為**轉(zhuǎn)運(yùn)速率( ug  min -1); po為**初始濃度(ug·mL-1) ;A為細(xì)胞單層的表面積(cm2)。

  MSN憑借其巨大的比表面積可以**提高**的口服生物利用度,而經(jīng)過(guò)氨基修飾的MSN通過(guò)與胃腸道表面黏蛋白的相互黏附,更加**促進(jìn)了**的吸收。同樣,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MSN和NH2-MSN在較高濃度時(shí)具有一定的細(xì)胞毒性,一方面是由于其巨大的比表面積與細(xì)胞接觸時(shí)破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定﹐另一方面可能由于制備時(shí)模板劑CTAB未能除盡而引起細(xì)胞毒性,前者在口服給藥中難以避免,因?yàn)榻档土吮缺砻娣e也會(huì)降低與胃腸道的接觸面積而降低吸收,后者可以在后續(xù)的研究中改進(jìn)合成工藝來(lái)解決。

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