丙型肝炎病毒(HCV)是世界范圍內(nèi)慢性病毒性肝炎的主要病原之一,約有1.7億人被感染,常導(dǎo)致嚴(yán)重肝病,包括肝硬化和肝細(xì)胞**(HCC) 1HCV的基因組含有一個(gè)長(zhǎng)的開放閱讀框架( ORF),編碼一個(gè)約3 010個(gè)氨基酸殘基( aa)組成的多蛋門,該多蛋白被細(xì)胞和病毒蛋白酶切割產(chǎn)生至少10個(gè)病毒基因產(chǎn)物:核心蛋自( core:).E1 、E2 、 p7, NS2 , NS3 , NS4A,NS4B , NS5A和 NS5B蛋白等2。F蛋門是 HCV基因組[ RNA 的核心蛋白編碼序列表達(dá)了1個(gè)17 kD的蛋白。關(guān)于其功能研究較少。我們利用**性消減雜交( suppression sub-tractive hybridization , SSH)技術(shù),對(duì)于表達(dá)HCV F載體轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞進(jìn)行研究,闡明了F蛋白反式激活的部分靶基因,同時(shí)我們結(jié)合生物信息學(xué)( bioinformat-ics)技術(shù)克隆了F蛋白反式激活的新型靶基因,即丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)基因。為了進(jìn)一步研究此蛋白與人體細(xì)胞的相互作用,我們?cè)诮湍讣?xì)胞中表達(dá)了HCV FTP2基因。

材料與方法

一.材料

HepG2細(xì)胞及感受態(tài)大腸桿菌DH5 α,c-myc單克隆抗體,ATCC的1-9E10.2雜交瘤產(chǎn)生。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgC。酵母細(xì)胞AH109、載體. pC-BKT7及酵母YPD培養(yǎng)基、SD/ - Trp、- Leu等培養(yǎng)基。Taq DNA聚合酶。T4 DNA 連接E,EcoRI和 BamHI 。內(nèi)烯既胺.N，N'-亞華雙山烯酰胺.異丙基硫代-j-D-半乳糖(1PTG)及X-3-Gal及pGEM-T載體。TEVED 。醋酸肛.半硫酸腺苷。

二.HCV FTP2基因的擴(kuò)增

根據(jù)電子拼接的基樹序列,在編碼區(qū)的土游和下游分別設(shè)計(jì)合成一對(duì)寡聚核苷酸引物(PI5'-GAA TTCATG GCA GGT CCA GAA AGT-3`和P2 5 '-GGA TCC TTATGT TGC TTT CACAGC-3 '.在引物的兩端引人了 EcoRI及BamHI隨切位點(diǎn),引物由上海生工公司合成。在0.5 mL的Eppendorf 管中依次加入17.3 pL雙蒸水.2.5;山L的10×緩沖液(含 20 mmol·L.' MgCl, ) .2 pl 2.5mmol-1.'dVTP. 1 ,.l 10 ;.mmol ·I. ' P1 , l ,l 10 pimmol ·L-' P2. 1 ,ul cDNA模板.0.2;l Taxq DNA聚合酶(5× 105U·L-'),放入PE9600 PCR役中擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃變性35 s,58℃退火35 s.72℃延伸 45 s,循環(huán)35次后,72℃保溫10 min。20 g·l.'瓊指糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果,

三.pGBKT7-HCV FTP2的構(gòu)建與鑒定

將經(jīng)玻璃奶回收、粉/瓢仿抽提.乙醇沉淀的上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pGEM-T載體按3:l mol./L.混合,在16℃用 TDNA連接商連接過(guò)夜,隨后轉(zhuǎn)化入用氯化鈣法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)抱.在鋪有IPTG;及5-澳-4氯-3嗚噪-3-D-半乳糖干(X-3-Gal)的氨芐西林瓊脂糖平板上進(jìn)行藍(lán)白菌落篩選,挑取自色菌落用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行梅切鑒定及測(cè)序,證明 HCVFTP2基因已被克隆進(jìn)T載體。該質(zhì)粒及pGBKT7;均用 EcoRI及BamH兩切,在T載體上釋放的HCV FTP2基因用上述相同的方法連接到pGBKT7載體中,轉(zhuǎn)化后接種于卡那霉素平板上,隨機(jī)挑收平板上生長(zhǎng)的菌落,堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA,雙醇切及PCR 鑒定。

四、HCV FTP2在酵母細(xì)胞中表達(dá)

轉(zhuǎn)化酵母細(xì)覽AH09并長(zhǎng)達(dá)州醋酸法轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化后鋪板于SD/-Trp進(jìn)行篩選。挑取2 mm 、3 mm大小的菌落過(guò)夜培養(yǎng)后、提取存母蛋自質(zhì)。表達(dá)產(chǎn)物的十二烷基奭酸鈉聚丙烯-酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和!Westernblot免疫印跡分析均按常規(guī)方法進(jìn)行。由于在酵母表達(dá)載體pGBKT7的多克隆位點(diǎn)前帶有人c-myc的標(biāo)簽,我們所表達(dá)的融合蛋白亦帶此標(biāo)簽,因此用抗人c-mye單克隆抗體與之進(jìn)行免疫反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一、載體構(gòu)建

HCV FTP2基因的擴(kuò)增和lpGBKT7-HCV FTP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建(圖1)。

圖IpGBK17-HCV FTP2質(zhì)粒圖

二、pGBKT7-HCV FTP2質(zhì)粒酶切鑒定

利用自行設(shè)計(jì)的引物Pl/P2成功擴(kuò)增出 HCVFTP2基閃片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g.1~'瓊脂糖凝膠電泳分析顯示擴(kuò)增片段約177 bp,預(yù)期片段符合,且無(wú)非特異擴(kuò)增現(xiàn)象。用PCR擴(kuò)增HCV FTP2基因測(cè)序結(jié)果顯示序列王確。用雙酶切所得片段,連接到用相同的EcoRI及 BamHl 所切的pGBKT7中經(jīng)酶切鑒定所獲結(jié)果正確(圖2)。

圖2pGBKT7-HCV FTP2 EcoRI 及 BamHI 酶切鑒定

由此表明HCV FTP2基因已正確克隆人熊母表達(dá)載體 pGBKT7 中 , pGBKT7-HCV FTP2質(zhì)粒構(gòu)建成功。

三、pGBKT7-HCV FTP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母AH109株

用醋梭鋰法轉(zhuǎn)化能母后在SD/-Trp培養(yǎng)基上篩選生長(zhǎng)。山于AH109株為色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷,質(zhì)粒pG-BKT7中帶有色氨酸基因,轉(zhuǎn)化成功的AH109可以在缺少色氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。培養(yǎng)數(shù)天后,挑取一菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增HCV FTP2基因。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化成功(圖3)

四、表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western免疫印跡分析

提取未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒與j轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的辭母蛋自質(zhì),進(jìn)行SDS-PAGE和lWesternblot統(tǒng)絞印跡分析結(jié)果(圖 43結(jié)果顯示對(duì)照無(wú)表達(dá)而轉(zhuǎn)化了pGK77-HCV FTP2的酵f母蛋白提取物Western blut印跡分析可見明顯條帶且無(wú)雜帶。

圖3pGBK17-HCV FTP2菌落進(jìn)行PCR鑒定

圖4HCV FTP2 Western blotting分析1道是HV FTP2蛋白.2道是陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)化PCBKT7空載體,3未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

F蛋白是一個(gè)新鑒定的HCV基{國(guó)產(chǎn)物 3-5。編碼F蛋白的開放閱讀框與核心蛋門的編碼序列重疊，是翻譯過(guò)程中核糖體閱讀框發(fā)生-2/＋!位漂移產(chǎn)生的,與核心蛋自具有相同的N-端序列。下蛋白與核心蛋白.NS5A相似,亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)5-91,但顯示比核心蛋白有更多的序列差異性,核心蛋自的突變導(dǎo)致患者逃避宿主免疫反應(yīng),可能觸發(fā)了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。核心蛋門的某些功能是否是F蛋白的作用,F蛋白是否調(diào)控HCV RVA的復(fù)制,是否參與病海的形態(tài)形成及在病毒生命周期中調(diào)節(jié)細(xì)胞功能是否發(fā)揮重要作用、尚不清楚。為進(jìn)一步研究f蛋自的功能,明確F蛋白

在丙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用,我們構(gòu)建酵母雙雜交表達(dá)載體并在熊母細(xì)胞中表達(dá)了HCV FTP2基因。

辭母是一種低等真核生物,與原核細(xì)胞相比在翻譯加工方面其有明顯的優(yōu)點(diǎn),例如蛋白質(zhì)中二硫鍵的**形成.糖基化,磷酸化.寡聚體的形成等。另外,他比哺乳動(dòng)物細(xì)胞操作簡(jiǎn)便,容易培養(yǎng),因此酵母細(xì)胞作為一種真核基因的表達(dá)系統(tǒng)有著良好的前景。我們?yōu)榱搜芯?/span>HCV FTP2的作用,克隆了HCV FTP2基因,把HCV FTP2基因在酵母表達(dá)載體pGBKT7中與c-myc標(biāo)簽基因片段及DVA結(jié)合域(GAlA:.1s7,氨基酸基因)基國(guó)在酵母表達(dá)載體中融合成功并且表達(dá),在Westernblot免疫印跡分析時(shí)用其標(biāo)簽單克隆抗體檢測(cè)到大小符合融合蛋自大小的蛋白質(zhì).說(shuō)明HCV FTP2融合蛋白在酵母中表達(dá)成功。表達(dá)產(chǎn)物存在于酵母細(xì)胞內(nèi)。隨著基因組計(jì)劃的完成,以后的研究進(jìn)入了后基因組和蛋自質(zhì)組階段, pGBK17 - HCN FTP2酵母雙雜交融合蛋白“餌”表達(dá)系統(tǒng)的建立,為研究HCV FTP2與細(xì)胞內(nèi)蛋自的相互作用奠定了基礎(chǔ),對(duì)深入了解HCVFTP2的結(jié)構(gòu)與功能以及在人體中對(duì)宿主細(xì)胞的作用提供幫助。

西安pg電子官方生物供應(yīng)抗體種屬∶兔抗單克隆抗體，鼠抗單殼隆抗體。兔抗多殼隆抗體�？贵w的濃度為1mglml。抗體及相關(guān)標(biāo)記抗體:HRP標(biāo)記抗體，Biotin標(biāo)記抗體，Gold標(biāo)記抗體，RBITC標(biāo)記抗體，AP標(biāo)記抗體,FITC標(biāo)記抗體，Cy3標(biāo)記抗體，Cy5標(biāo)記抗體，Cy5.5標(biāo)記抗體，Cy7標(biāo)記抗體，PE標(biāo)記抗體，PE-Cy3標(biāo)記抗體，PE-Cy5標(biāo)記抗體，PE-Cy5.5標(biāo)記抗體，PE-Cy7標(biāo)記抗體，APC標(biāo)記抗體，AlexaFluor 350標(biāo)記抗體，Alexa Fluor 488標(biāo)記抗體，Alexa Fluor 555標(biāo)記抗體，AlexaFluor647標(biāo)記抗體抗體的交叉反應(yīng)︰人，小鼠，大鼠，雞，狗，豬，羊，牛，兔.....抗體的應(yīng)用:可以用于做石蠟切片免疫組化，冰凍切片兔疫組化，Elisa , wB，免疫熒光等實(shí)驗(yàn)。

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zzj 2021.3.25