新型交聯(lián)劑琥珀酰亞胺酯雙吖丙啶/N-羥基琥珀酰亞胺酯雙吖丙啶NHS–ester diazirine)SDA/LC-SDA /SDAD 衍生物

琥珀酰亞胺酯雙吖丙啶（succinimidyl ester diazirine,SDA）試劑是一類新型的交聯(lián)劑，其可將已被證實(shí)的氨基反應(yīng)化學(xué)與創(chuàng)新且**的基于雙吖丙啶的光化學(xué)結(jié)合，用于將含有氨基的分子交聯(lián)到幾乎所有其他功能基團(tuán)上。SDA交聯(lián)劑包括六種化合物，它們具有不同的間隔臂長(zhǎng)度，不同的剪切交聯(lián)蛋白的能力以及不同的膜通透性（有或無(wú)帶電基團(tuán)）。蛋白交聯(lián)是用于研究蛋白結(jié)構(gòu)以及穩(wěn)定蛋白-蛋白相互作用的重要技術(shù)。

在捕獲蛋白相互作用時(shí)，雙功能性氨基或巰基反應(yīng)交聯(lián)劑需要兩種蛋白上的特定氨基酸基團(tuán)（例如，賴氨酸或半胱氨酸）具有適當(dāng)?shù)拈g距。SDA交聯(lián)劑通過(guò)使用氨基反應(yīng)活性的N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS ester）對(duì)一種蛋白進(jìn)行特定標(biāo)記，然后使用紫外線活化將雙吖丙啶交聯(lián)于**種蛋白的任意氨基酸側(cè)鏈或肽段骨架上，從而避開(kāi)了這一限制�；�于雙吖丙啶的光交聯(lián)劑較基于苯基疊氮化物的光交聯(lián)劑具有更好的光穩(wěn)定性，并且易于被長(zhǎng)波紫外光（330-370nm）活化。

N-羥基琥珀酰亞胺酯雙吖丙啶(NHS–ester diazirine) 衍生物（SDA，LC-SDA 和SDAD ）缺少帶電基團(tuán)，因此具有膜通透性。此特性使其適于用于細(xì)胞內(nèi)和膜內(nèi)交聯(lián)。相反，Sulfo–SDA，Sulfo–LC–SDA 和Sulfo–SDAD 含有帶負(fù)電荷的硫酸根基團(tuán)，改善了其水溶性并降低了其膜通透性，因此可將其用于細(xì)胞外蛋白的交聯(lián)。SDAD 和Sulfo–SDAD 的間隔臂中還含有一個(gè)二硫鍵，可被還原劑剪切。

使用NHS–Diazirine進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外蛋白的光反應(yīng)性交聯(lián)為了證明使用SDA試劑將細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合體進(jìn)行光反應(yīng)性交聯(lián)，我們檢測(cè)了HeLa細(xì)胞中有關(guān)早期內(nèi)吞體抗原1(early endosome antigen, EEA1）蛋白的蛋白相互作用。EEA1通過(guò)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled coil domain) 形成同源二聚體，結(jié)合到磷脂囊泡上, 參與內(nèi)吞體的運(yùn)輸。細(xì)胞用各種NHS-Diazirine衍生物孵育并用紫外光處理。然后將細(xì)胞裂解并進(jìn)行SDS–PAGE分析，使用抗EEA1抗體進(jìn)行Western blotting 分析。暴露于紫外線后，EEA1遷移率降低的形式僅在SDA和SDAD處理的樣品中檢測(cè)到，而在模擬處理對(duì)照樣品中未檢測(cè)到（如圖）。

NHS-ester diazirine 交聯(lián)機(jī)制。在pH 值為7-9 的緩沖液中，NHS ester 與伯胺基團(tuán)（-NH2）**反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵并釋放NHS。使用長(zhǎng)波紫外光（330-370）光活化雙吖丙啶形成有活性的碳烯中間體。這樣的中間體通過(guò)進(jìn)一步反應(yīng)與對(duì)應(yīng)間隔臂長(zhǎng)度距離上的任意氨基酸側(cè)鏈或肽段骨架形成共價(jià)鍵。

由于EEA1是細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合體，它不會(huì)被不透細(xì)胞膜的Sulfo–SDA交聯(lián)。此外，具有更低遷移率的、SDAD–交聯(lián)的EEA1可被還原劑二硫蘇糖醇（dithiothreitol, DTT）在間隔臂內(nèi)剪切。為了說(shuō)明細(xì)胞膜蛋白交聯(lián)，我們對(duì)比了使用可逆的磺化的N–羥基琥珀酰亞胺–雙吖丙啶（Sulfo–SDAD），磺化的苯基疊氮化物交聯(lián)劑（sulfonated phenyl azide, Sulfo–SANPAH）或同源雙功能N–羥基硫代琥珀酰亞胺酯（BS3）處理細(xì)胞后異二聚體鈉/鉀（Na/K）ATPase 的交聯(lián)情況。樣品使用BCA蛋白定量法標(biāo)準(zhǔn)化蛋白含量，并且使用抗GAPDH的抗體檢測(cè)以表明等量上樣。暴露于紫外線后，通過(guò)Western Blotting觀察，使用Sulfo–SDAD處理的樣品比使用Sulfo–SANPAH或BS3處理的樣品明顯具有更多的細(xì)胞表面Na/Kβ鏈交聯(lián)產(chǎn)物。

NHS-Ester Diazirine（SDA）交聯(lián)劑在細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)EEA1 蛋白復(fù)合體。HeLa 細(xì)胞（2×106） 在PBS 中用1mM 的SDA，Sulfo-SDA，LC-SDA 或SDAD 標(biāo)記10 分鐘。未反應(yīng)的NHS ester 用終濃度100mM，pH8.0 的Tris?HCl 淬滅5 分鐘，然后用PBS 洗滌。NHS-diazirine 標(biāo)記的細(xì)胞和模擬處理對(duì)照在PBS 中使用Stratalinker2400 在365nm 處紫外線照射15 分鐘，距離為4cm。紫外線處理后，裂解細(xì)胞提取蛋白，使用BCA 蛋白定量試劑盒分析總蛋白濃度。除了一個(gè)重復(fù)的SDAD處理樣品（-DTT）之外，每個(gè)樣品取10μg 加入還原性樣品緩沖液，用SDS-PAGE 進(jìn)行分離。結(jié)果使用抗EEA1 抗體通過(guò)Western blot 進(jìn)行分析。

wyf 03.25