Ab-PROTAC偶聯(lián)物是將PROTAC選擇性遞送至特定細(xì)胞的一種方法�？贵w-**偶聯(lián)物（ADC）可以將毒素特異性地傳遞給**細(xì)胞，大程度減少毒副作用。ADC還可以增強曲妥珠單抗（Herceptin）或培妥珠單抗（Perjeta）等單克隆抗體的，然而由于ADC固有的局限性（例如被非靶向細(xì)胞攝取），**只有少數(shù)ADC獲得FDA批準(zhǔn)。ADC發(fā)展面臨的主要挑戰(zhàn)與劑量限制性毒性（DLT）有關(guān)，即功效與脫靶毒性之間難以平衡。ADC的另一個缺點是實際傳遞到中的**劑量很少，這意味著**分子必須具有**的細(xì)胞毒性，這可能會導(dǎo)致毒副作用。由于PROTAC具有催化性進而較低劑量便可降解目標(biāo)蛋白，因此PROTAC可能是ADC的理想負(fù)載。

采用曲妥珠單抗-PROTAC偶聯(lián)物可以實現(xiàn)PROTAC的組織選擇性遞送，并在HER2陽性細(xì)胞中選擇性降解目標(biāo)蛋白。偶聯(lián)物將特異性結(jié)合HER2/neu受體，通過內(nèi)吞進入細(xì)胞后被溶酶體分解釋放出活性PROTAC（見圖1A）。鑒于BRD4是炎癥和**癥的潛在靶標(biāo)，探索了****細(xì)胞模型中利用曲妥珠單抗和PROTAC偶聯(lián)物實現(xiàn)特異性細(xì)胞類型中BRD4降解的潛力。

本文**選擇BRD4降解劑MZ1的類似物PROTAC 1進行概念驗證研究（圖1B）。據(jù)報道100 nM MZ1處理細(xì)胞4小時后便可實現(xiàn)BRD4的完全降解，這種類型的PROTAC由BET的配體JQ1和VHL的配體組成。

**制訂了通過疊氮和炔的環(huán)加成反應(yīng)將PROTAC和曲妥珠單抗偶聯(lián)的策略。利用化合物1的VHL配體部分上的游離羥基來結(jié)合疊氮端的PEG生成疊氮功能化的PROTAC，該羥基對于VHL的結(jié)合不可或缺，因此結(jié)合將PROTAC活性直到被溶酶體水解后才能生成活性的PROTAC。之后還原曲妥珠單抗的二硫鍵并與化合物13反應(yīng)生成炔基功能化的曲妥珠單抗并將反應(yīng)物在pH 8.5緩沖液中孵育過夜使其水解為具有血清穩(wěn)定性的馬來酰胺酸，后通過炔基官能化的曲妥珠單抗和疊氮-PROTAC 2之間的反應(yīng)獲得具有可控載荷和具有血清穩(wěn)定性的Ab-PROTAC 3偶聯(lián)物，從而確保了偶聯(lián)物僅可通過酯基的水解釋放PROTAC。Ab-PROTAC 3偶聯(lián)物的合成由于沒有采用銅（I）催化而排除了銅（I）的副作用。LC-MS分析顯示了偶聯(lián)物的成功合成，ELISA證實了抗體結(jié)合后活性仍完全保留。此外作者還是發(fā)現(xiàn)Ab-PROTAC 3具有穩(wěn)定性：在37攝氏度pH 7.4的PBS中孵育4小時后仍有98.8％均保持完整結(jié)構(gòu)，在孵育24小時后結(jié)構(gòu)完整的偶聯(lián)物仍高達(dá)83.5％（見圖1E）。

基于細(xì)胞系中HER2/neu受體和BRD4的表達(dá)水平（見圖2A、2B）和在測試相同條件下細(xì)胞系中游離PROTAC 1降解BRD4的能力（圖2C），研究者選擇了兩種HER2陰性****細(xì)胞系（MCF-7和MDA-MB-231）和兩種HER2陽性****細(xì)胞系（SK-BR-3和BT-474）來檢測Ab-PROTAC 3的生物學(xué)活性。HER2 +和HER2-表型中，PROTAC 1對BRD4的降解差異性可能與細(xì)胞系中BRD4的表達(dá)差異有關(guān)。每種細(xì)胞系均用PBS、抗體（曲妥珠單抗）或陽性對照4（圖2E）或不同濃度的Ab-PROTAC 3處理，并將BRD4降解劑4對BRD4的降解量作為陽性對照。認(rèn)識到Ab-PROTAC 3在生理pH下穩(wěn)定，作者在無血清培養(yǎng)基中用Ab-PROTAC 3處理細(xì)胞4小時或在處理1小時后將偶聯(lián)物除去再培養(yǎng)23小時。

WB分析（圖2D）表明Ab-PROTAC 3僅選擇性降解HER2+細(xì)胞中的BRD4，而對HER2-細(xì)胞中的BRD4無影響。用100 nM Ab-PROTAC 3處理細(xì)胞4 h，僅在HER2+細(xì)胞系中觀察到了BRD4的完全降解（50 nM也能觀察到BRD4顯著降解），而在任何測試濃度下HER2-細(xì)胞系均未觀察到降解。此外，用Ab-PROTAC 3處理HER2+細(xì)胞1小時后除去Ab-PROTAC 3繼續(xù)孵育23小時也觀察到了BRD4的顯著降解，這表明偶聯(lián)物在1小時的期內(nèi)已充分進入到HER2+細(xì)胞中并被溶酶體分解產(chǎn)生了劑量的PROTAC 1。由于Ab-PROTAC 3對缺少HER2/neu受體表面的細(xì)胞不能進行HER2/neu介導(dǎo)的內(nèi)化，因此沒有觀察到降解。應(yīng)該注意，在用曲妥珠單抗處理細(xì)胞的任何實驗中均未觀察到BRD4降解。這些實驗結(jié)果證明了HER2/neu介導(dǎo)的抗體-PROTAC偶聯(lián)物能選擇性傳遞PROTAC。

接下來，進一步探究Ab-PROTAC 3是否通過蛋白酶體誘導(dǎo)BRD4降解，在使用/不使用蛋白酶體劑硼替佐米（BTZ）的情況下，將細(xì)胞與PBS、陽性對照4或100 nM Ab-PROTAC 3孵育后將細(xì)胞裂解，WB顯示了蛋白酶體劑可阻止兩種HER2+細(xì)胞系中Ab-PROTAC 3介導(dǎo)的BRD4降解（圖2F）。

受體介導(dǎo)的抗體內(nèi)化已通過不同方法進行了廣泛研究，包括放射標(biāo)記、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)或細(xì)胞毒性測定。其中，使用熒光標(biāo)記抗體的共聚焦顯微鏡可以對抗體在不同細(xì)胞區(qū)室（例如內(nèi)體或溶酶體）進行定位。先前有研究報道使用這種方法確定曲妥珠單抗的內(nèi)化和細(xì)胞內(nèi)區(qū)室化，證明HER2/曲妥珠單抗復(fù)合物的內(nèi)體內(nèi)化�？紤]到這些先例，作者旨在通過共聚焦顯微鏡研究活細(xì)胞中Ab-PROTAC 3的運輸，以確認(rèn)內(nèi)化并進一步分析結(jié)合物在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的情況。對于這些研究，使用了熒光標(biāo)記的AlexaFluor488-Ab-PROTAC（AF488-3），將HER2 + SK-BR-3細(xì)胞與100 nM AF488-3孵育1小時后洗滌細(xì)胞，并在1、4、8和24小時的時間成像以研究復(fù)合物的運輸（見圖3A）。1 h時在細(xì)胞表面觀察到AF488-3，而在孵育4 h后AF488-3已經(jīng)部分進入到不同的細(xì)胞室內(nèi)，大概是初級和次級內(nèi)體（圖3A和3C）。8小時后AF488標(biāo)記的區(qū)室與溶酶體廣泛共定位（圖3A和3C）；在沒有將結(jié)合物洗脫的情況下也觀察到了相似的結(jié)果。溶酶體消化Ab-PROTAC 3后須釋放游離的活性PROTAC 1，然后進入細(xì)胞核以才能觸發(fā)BRD4降解。在相同條件下表達(dá)**水平的HER2受體的MCF-7細(xì)胞無法攝取AF488-3（圖3B），這與這些細(xì)胞的BED4不能被Ab-PROTAC誘導(dǎo)降解一致。

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