聚苯乙烯微球ps表面抗體取向偶聯(lián)的一般方法和原理

納米探針已經(jīng)在體外診斷領域得到了廣泛的應用。然而在一般方法中，抗體通常是方向隨機地吸附或偶聯(lián)在納米顆粒載體上，其抗原識別位點容易被占用或受到空間位阻的影響，導致納米探針對抗原的特異性結合能力降低。為了改善抗體取向，使更多抗原結合位點充分暴露，研究者們提出了一系列新方法，代表性的技術包括利用抗體特殊位點（如Fc端寡糖鏈、鉸鏈區(qū)二硫鍵）、引入夾層蛋白（如蛋白A、蛋白G、蛋白L）、分子印跡、抗體融合His-tag等。這些方法通常操作步驟比較復雜，成本較高，或需要對抗體改性，或需要引入新的組分，不易向?qū)嶋H應用中轉(zhuǎn)化。

開發(fā)了一種簡單的抗體取向結合在聚苯乙烯納米顆粒表面的方法，即基于大家熟悉的EDC/Sulfo-NHS交聯(lián)法，調(diào)整抗體和載體納米顆粒的反應pH，并將這一條件下制備的探針用于心肌肌鈣蛋白I 側向免疫層析檢測。結果表明，抗體結合量和結合取向以及抗原檢測靈敏度都得到了**提高。雖然調(diào)節(jié)pH值是優(yōu)化抗體結合常用的手段,但本文次深入探討了該手段增強抗體取向的機制,并揭示了抗體密度、電荷分布和親疏水性的重要性，物理吸附和化學偶聯(lián)速度以及其他因素對抗體取向的影響。當pH降至略低于抗體等電點時，一方面，抗體的電荷分布和親疏水區(qū)域分布更有利于其以“tail-on”取向；另一方面，抗體和載體間化學交聯(lián)速度減緩，提供了更長的窗口時間，使抗體在納米顆粒表面微環(huán)境的影響下更充分地調(diào)節(jié)取向。該方法提高抗體結合量的意義還在于，當抗體結合密度足夠高時，抗體能夠垂直緊密排列在載體表面，使探針結構更加有序和穩(wěn)定。

圖1 熒光免疫層析測定cTnI，探針制備時抗體投料量: (A) 50μg; (B) 200μg；(C) 抗體的三個維度尺寸

圖2 (A) IgG1小鼠單克隆抗體(1IGY)的三維晶體結構。左上角:前視圖;右上角:側視圖;左下角:俯視圖;右下角:底部視圖。堿性和酸性氨基酸基團分別用藍色和紅色標記。(B) Fab 2和Fc片段上堿性和酸性氨基酸的數(shù)量。(C)(Fab)2和Fc片段在不同pH下的凈電荷量，忽略保守的糖鏈，電荷分布與pI的實測值不完全一致。

圖3 pH對抗體取向偶聯(lián)的影響及機制

這一簡單、實用的方法適用于優(yōu)化各種IgG型抗體的取向。充分探討在化學交聯(lián)過程中影響抗體取向的因素，也有助于更好地指導我們調(diào)節(jié)實驗條件，從而構建更高性能的探針，從而實現(xiàn)高性能的體外診斷試劑開發(fā)。

wyf 04.12