DSPE-PEG-VS 介導的抗體定向偶聯(lián)策略

鏈接：https://www.cell.com/molecular-therapy-family/molecular-therapy/fulltext/S1525-0016(05)00162-0

作者：安妮特 ·威爾遜，亨特，肖恩· 阿爾伯，唐志，史蒂文· 肯內(nèi)爾，西蒙· 沃特金斯，葉 黃，布魯斯· 皮特，宋麗 

摘要：

肺內(nèi)皮在維持正常肺部生理功能方面發(fā)揮著重要作用，其功能障礙與多種肺部疾病有關(guān)。通過反義寡脫氧核苷酸 (ODN) 糾正內(nèi)皮功能障礙依賴于開發(fā)一種能夠高效地將 ODN 遞送至肺內(nèi)皮且毒性*小的遞送載體。為此，我們開發(fā)了一種新型脂質(zhì)載體，能夠高效地將 ODN 靶向遞送至肺內(nèi)皮。該方法基于一種利用可離子化的氨基脂質(zhì)（1,2-二油酰-3-二甲基丙烷銨）和含乙醇的緩沖體系將大量多聚陰離子 ODN 包裹在脂質(zhì)囊泡中的方法。內(nèi)皮特異性*體 (273-34A) 通過二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇間隔物被整合到脂質(zhì)囊泡中。 273-34A*體在體外和體內(nèi)均能有效介導ODN遞送至小鼠肺內(nèi)皮細胞。此外，該制劑的全身給藥具有*低的血液學毒性，且?guī)缀醪粫�引起全身和肺部血液動力學的急性變化。這些結(jié)果為脂質(zhì)介導的ODN遞送用于*肺部疾病奠定了基礎(chǔ)。此外，該方法還可作為表征肺內(nèi)皮細胞基因功能的研究工具。

材料和方法

脂質(zhì)和化學物質(zhì)

EPC、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N- [甲氧基（聚乙二醇）2000]、1,2-二硬脂�；�-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DSPE) 和 DODAP 購自 Avanti Polar Lipids, Inc.（美國阿拉巴馬州阿拉巴斯特）。CH、3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯 (SPDP)、二硫蘇糖醇 (DTT)、大鼠 IgG 和細菌（大腸桿菌）LPS 購自 Sigma-Aldrich（美國密蘇里州圣路易斯）。α-乙烯基砜、聚乙二醇-丙酸的 ω- N-羥基琥珀酰亞胺酯 MW 3400 (NHS-PEG-VS) 購自 Shearwater Polymers（美國阿拉巴馬州亨茨維爾）。 DSPE-PEG-VS（MW 2507）按照之前的方法合成[39]。

*體

使用大鼠*鼠TM (273-34A) 作為特異性配體，其制備方法參見[30]。以正常大鼠IgG作為對照配體。大鼠*鼠ICAM-1單克隆*體YN1/1購自eBioscience公司（美國加利福尼亞州圣地亞哥）。Alexa Fluor-488山羊*鼠IgG購自Molecular Probes公司（美國俄勒岡州尤金）。

寡核苷酸

所有ODN均以硫代磷酸酯骨架合成，但用于核酸酶分析的ODN除外，該ODN以PO骨架合成（美國德克薩斯州米德蘭市米德蘭認證試劑公司）。用于攝取和分布研究的ODN由Cy3標記的ODN與未標記的ODN組成，比例為1:4（w/w）。

含ODN的脂質(zhì)囊泡的制備

按照Semple等人 [20]描述的方法制備含ODN的脂質(zhì)囊泡。簡而言之，在100%乙醇中制備由EPC:CH:DODAP [25:52:20 (m/m)]組成的脂質(zhì)溶液。為了制備*體靶向脂質(zhì)囊泡，將3 mol%的DSPE-PEG-VS添加到脂質(zhì)中。在單獨的試管中，用300 mM檸檬酸（pH 4.0）制備ODN。預熱溶液，然后將脂質(zhì)溶液緩慢添加到ODN中，直至乙醇的*終濃度為40% (v/v)。ODN:脂質(zhì)的輸入比為0.15 (w/w)。將混合物通過100 nm聚碳酸酯濾膜。將制劑對pH 4.0的檸檬酸鹽緩沖液進行透析，并進一步對pH 7.6的Hepes緩沖液進行透析。*后通過凝膠過濾將含有ODN的脂質(zhì)囊泡與游離ODN分離，并按文獻[9]的方法測定囊泡的大小和ζ電位。

*體（Ab）硫醇化并與脂質(zhì)囊泡偶聯(lián)

通過與SPDP反應(yīng)制備硫醇化*體。然后用DTT處理還原*體上的PDP基團。將含有DSPE-PEG-VS的脂質(zhì)囊泡與硫醇化*體在22°C下孵育2小時，然后在4°C下孵育過夜，并輕輕攪拌。通過凝膠過濾去除未結(jié)合的*體。

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