在開(kāi)發(fā)了表征多組分Fab-CKP-NLP偶聯(lián)物的方案和分析工具后，我們接下來(lái)研究了控制CKP和Fab負(fù)載密度的能力，并評(píng)估了這些參數(shù)對(duì)Fab-CKPNLP大小、活性和血清穩(wěn)定性的影響。

CKP-NLP與10 mol%的DOPE-PEG-Mal以兩種CKP負(fù)載密度組裝，12.7 CKP/NLP（稱為低CKP-NLP）和40 CKP/NLP（稱為高CKP-NLPs），并以不同的Fab與CKP-NLP比率與Fab結(jié)合。

顯示了低CKP-NLP與Fab結(jié)合的SEC色譜圖，F(xiàn)ab與CKP-NLPs的比例范圍為0至150。值得注意的是，在*高Fab:NLP比為150時(shí)，對(duì)應(yīng)于約1 Fab:1 DSPE-PEG-Mal。CKP-NLP峰隨著Fab濃度的增加而逐漸增加，達(dá)到約150的飽和水平。隨著Fab結(jié)合率的增加，觀察到Fab二聚體和未結(jié)合的Fab峰逐漸增加。對(duì)于高CKP-NLP重復(fù)了這一過(guò)程，并按照材料和方法中的描述對(duì)Fab共軛量進(jìn)行了定量。

對(duì)于這兩種CKP組合物，當(dāng)反應(yīng)中Fab:NLP的比例從0增加到100時(shí)，觀察到共軛Fab負(fù)載量（實(shí)際附著在NLP上的量）呈線性增加。然而，在較高比率下，觀察到Fab負(fù)載量幾乎沒(méi)有增加，與NLP表面結(jié)合的Fab的飽和量被確定為約50Fab/NLP。

先前報(bào)道，當(dāng)以10mol%的DOPE MCC脂質(zhì)組合物通過(guò)DOPE-MCC脂質(zhì)直接偶聯(lián)到NLP表面時(shí)，F(xiàn)ab負(fù)載能力為30。這種裝載能力被認(rèn)為是由可用的NLP表面積驅(qū)動(dòng)的，NLP表區(qū)域與30 Fab所占的總表面積之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。CKP-NLP的表面積與之前的出版物相似，因此Fab負(fù)載的增加不能歸因于表面積的增加。

此外，我們觀察到在沒(méi)有CKP的情況下，F(xiàn)ab結(jié)合能力也有類似的增加，這表明這種效應(yīng)不是由于NLP表面存在CKP造成的。在這項(xiàng)研究中，F(xiàn)abs沒(méi)有直接與表面結(jié)合，而是與從NLP表面延伸的PEG2000接頭結(jié)合。

因此，與直接共軛到NLP表面相比，間隔物增加了整體共軛體積和有限的空間位阻，允許更多的Fabs與NLP共軛，這是合理的。有趣的是，CKP密度對(duì)Fab負(fù)載沒(méi)有明顯影響�？紤]到在較高的CKP負(fù)載下可能存在更大的空間位阻，這有點(diǎn)出乎意料。PEG接頭也消除了CKP的任何空間影響，這是合理的，因?yàn)檫@在NLP表面和Fab負(fù)載的偶聯(lián)手柄之間創(chuàng)建了一個(gè)間隔物。

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