文獻(xiàn)：Ratiometric fluorescence imaging of cell surface pH by poly(ethylene glycol)-phospholipid conjugated with fluorescein isothiocyanate

作者：Ryuichi Ohgaki, Yuji Teramura, Daichi Hayashi, Lili Quan, Suguru Okuda, Shushi Nagamori, Madoka Takai & Yoshikatsu Kanai

文獻(xiàn)鏈接：https://www.nature.com/articles/s41598-017-17459-y

首先研究了即使在與PEG脂質(zhì)結(jié)合后，F(xiàn)ITC是否仍保持其pH依賴性熒光特性。將FITC-PEG脂質(zhì)懸浮在一系列不同pH值（pH 2.0-10.0）的緩沖溶液中。然后，在519的檢測波長下，用熒光分光光度計(jì)記錄激發(fā)光譜（400-510nm）?nm。

FITC-PEG脂質(zhì)的熒光在495處顯示主峰?nm和465處的肩峰?并且顯示出明顯的pH依賴性。使用氬激光線（458 nm和488 nm）驗(yàn)證我們的比率共焦激光掃描顯微鏡?nm），檢測路徑為500-550?nm，在相同的設(shè)置下記錄發(fā)射光譜。

在兩種激發(fā)波長下，F(xiàn)ITC-PEG脂質(zhì)的熒光強(qiáng)度在堿性中性pH值下較高，在酸性pH值下較低。中繪制了獲得的積分熒光比（500-550 nm）與pH值的關(guān)系圖，說明了與PEG脂質(zhì)結(jié)合的FITC的pH指示特性。該圖符合雙相雙位點(diǎn)競爭配體結(jié)合曲線。

結(jié)果表明，兩個(gè)不同的質(zhì)子化位點(diǎn)主要影響FITC-PEG脂質(zhì)的熒光比。拐點(diǎn)在pH 2.79和6.17，接近之前報(bào)道的陽離子中性形式FITC的pKa值（pKa?=?2.19) 和單陰離子二陰離子形式（pKa?=?6.33),分別為22。

熒光比在pH 2.0-7.5范圍內(nèi)具有獨(dú)特的值。然而，由于酸性pH值下的熒光強(qiáng)度較低，pH 4.5左右的動(dòng)態(tài)響應(yīng)較小，因此確定FITC-PEG脂質(zhì)的最佳檢測范圍在弱堿性和酸性pH值之間。當(dāng)pH 6.0的緩沖溶液中省略Na+和/或K+時(shí)，熒光比僅受到可忽略的影響，這表明探針對(duì)質(zhì)子的選擇性高于這些生理上單價(jià)陽離子。

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