文獻：Ratiometric fluorescence imaging of cell surface pH by poly(ethylene glycol)-phospholipid conjugated with fluorescein isothiocyanate

作者：Ryuichi Ohgaki, Yuji Teramura, Daichi Hayashi, Lili Quan, Suguru Okuda, Shushi Nagamori, Madoka Takai & Yoshikatsu Kanai

文獻鏈接：https://www.nature.com/articles/s41598-017-17459-y

摘要：

為了優(yōu)化成像分析的條件，我們接下來檢查了用FITC-PEG脂質(zhì)標記細胞表面的時間過程。將人胃印戒細胞癌KATO III細胞與FITC-PEG脂質(zhì)孵育0、1、5、10、20、30和60分鐘?min，并進行共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。

FITC-PEG脂質(zhì)的熒光僅在質(zhì)膜上檢測到。至少在60℃以下沒有觀察到熒光顯著內(nèi)化到細胞質(zhì)中?這與之前使用其他細胞系報道的FITC-PEG脂質(zhì)的細胞表面保留特性一致。根據(jù)每個孵育時間獲得的圖像，計算每個細胞的平均熒光強度，并繪制孵育時間圖。

KATO III細胞表面FITC-PEG脂質(zhì)的熒光強度在30?min。因此，F(xiàn)ITC-PEG脂質(zhì)標記的孵育時間固定為30?在接下來的所有實驗中。已證實，在這種情況下，用FITC-PEG脂質(zhì)孵育不會顯著影響KATO III細胞的存活率。

為了進一步證實FITC-PEG脂質(zhì)在細胞外表面的保留，在KATO III細胞中表達了mem mCherry（Lyn激酶N端肽和紅色熒光mCherry的融合蛋白）。Lyn激酶的N-末端序列接受脂肪�；�，這對于將蛋白質(zhì)錨定在質(zhì)膜的內(nèi)小葉是必要和充分的23。

FITC-PEG脂質(zhì)和mem mCherry都位于質(zhì)膜上。更高放大倍數(shù)的觀察和跨質(zhì)膜的峰值檢測表明，F(xiàn)ITC-PEG脂質(zhì)和mem mCherry的熒光信號大多重疊，但與mem mChurry相比，F(xiàn)ITC-PEG-脂質(zhì)的熒光峰值略微向外部偏移。

當mem-AcGFP（Lyn激酶N端肽和綠色熒光AcGFP的融合蛋白）與mem-mCherry共表達時，沒有觀察到熒光峰的這種變化（圖3d，e）。這些結(jié)果進一步支持FITC-PEG脂質(zhì)保留在KATO III細胞的細胞外表面。

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