選擇色譜填料的時(shí)候,一般不會(huì)選錯(cuò)填料的鍵合相(Bonded Phase)種類,但往往會(huì)選錯(cuò)孔相關(guān)的參數(shù),尤其是孔徑。一般色譜填料的孔徑是根據(jù)目標(biāo)物的分子大小、分子尺寸、水化半徑等性質(zhì)來(lái)選擇的,類似于膜過(guò)濾中膜孔大小的選擇;
一般小分子化合物(<1KDa,氨基酸,單糖等)選擇60?的孔,大一點(diǎn)的多肽分子(<3KDa,比伐盧定等)選擇100到120?孔,更大的多肽(>5KDa,胰島素等)需要選擇200?或以上的孔,更大分子量的蛋白或抗體的純化需要選擇2000A甚至更大的孔。
孔選擇結(jié)果的好與壞
一般色譜填料的制造過(guò)程會(huì)盡量避免過(guò)多的小孔,即孔徑分布的高斯曲線(Gaussian Curve)中左邊遠(yuǎn)離平均孔徑的那一部分,因?yàn)檫@一部分孔是容易形成對(duì)目標(biāo)物空間位阻(Steric Hindrance)的。
孔在色譜過(guò)程中重要的表現(xiàn)在于影響目標(biāo)物的傳質(zhì)作用(Mass Transfer),理想的孔徑大小是大到能讓目標(biāo)物隨流動(dòng)相自由遷移而不受到空間位阻作用,孔與孔之間全部通透,過(guò)小的孔和死胡同似的孔都會(huì)造成目標(biāo)物在色譜過(guò)程中的傳質(zhì)變差、增加譜帶展寬(Band Broadening),相鄰兩個(gè)峰靠得更近或交叉部分變大,從而影響分析效果或制備時(shí)收率(Recovery Yield)降低;更極端時(shí)過(guò)小的孔徑選擇會(huì)造成死吸附,洗脫時(shí)產(chǎn)品收率大幅降低,只有在再生(Regeneration)時(shí)才有可能被強(qiáng)洗脫能力流動(dòng)相洗脫或者堿破壞。
更大的平均孔徑可以降低小孔對(duì)目標(biāo)物的空間位阻,提高傳質(zhì)作用效率,分離效果變好;但是物極必反,也不是孔選的越大越好。但是更大的孔在孔容一定的情況下會(huì)降低填料的比表面積,有時(shí)會(huì)導(dǎo)致純化載量(Capacity)的降低。所以孔徑的選擇,不在大,合適就好。
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