流式細(xì)胞學(xué)的發(fā)展，重要的促進(jìn)力量是抗體，其次就是與儀器檢測能力配套的熒光染料。

現(xiàn)有的流式熒光染料可分為以下11大類：

1、有機(jī)小分子

提起有機(jī)小分子，大多數(shù)人肯定一頭霧水，但是如果我舉出幾個例子，肯定恍然大悟。

 FITC（分子量389 Da）、Alexa Fluor 488（FITC類似物，分子量643 Da）、Texas Red（TxRed，分子量625 Da）、Alexa Fluor 647（分子量1155 Da） 、Pacific Blue（分子量242 Da）和Cy5（分子量762 Da）。是不是基本上都用到過？

 這些有機(jī)小分子具有一致的發(fā)射光譜和較小的斯托克斯位移（激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的差，大約為50-100 nm），光穩(wěn)定好，容易與抗體偶聯(lián)，所以應(yīng)用豐富。

值得一提的是Alexa Fluor染料光穩(wěn)定性較FITC更好，所以如果要做成像的話，可選擇它們。

2、藻膽蛋白

藻膽蛋白（Phycobiliproteins）是從藍(lán)藻、鞭毛藻等藻類中提取的大蛋白分子，例如藻紅蛋白（PE）的分子量為240,000 Da。這些蛋白質(zhì)具有較大的斯托克斯位移（75-200 nm），并且具有穩(wěn)定的發(fā)射光譜。由于藻膽蛋白較大，因此它們在結(jié)合過程中通常具有1：1的蛋白質(zhì)與熒光染料比率，因此對于定量流式細(xì)胞術(shù)非常有用。

但是，藻膽蛋白易受光致漂白，因此不建議長時間或反復(fù)暴露于激發(fā)光源中。

藻膽蛋白家族中，除了藻紅蛋白（PE）外，還有別藻藍(lán)蛋白（APC）和苦瓜素葉綠素蛋白（PerCP）。

3、量子點(diǎn)

量子點(diǎn)（Qdots）是半導(dǎo)體納米晶體，具有與納米晶體尺寸密切相關(guān)的熒光發(fā)射光譜。它們適合被紫外或紫光激發(fā)，但也容易被其它激光少量激發(fā)，因此，在多參數(shù)實(shí)驗(yàn)中使用Qdots時，其它波長激光器的這種微小激發(fā)，卻會使熒光補(bǔ)償變得復(fù)雜。

4、高分子染料

高分子（聚合物）染料由收集光信號的聚合物鏈組成，可以根據(jù)聚合物鏈的長度和連接的分子亞基，“調(diào)節(jié)”吸收和發(fā)射特定波長的光。這些染料非常穩(wěn)定，并且與藻膽蛋白具有相似的量子效率，光穩(wěn)定性大大提高。

5、串聯(lián)染料

串聯(lián)染料將藻膽蛋白（PE，APC，PerCP）或高分子染料（BV421，BUV395）與有機(jī)小分子熒光染料（Cy3，Cy5，Cy7）化學(xué)偶聯(lián)，利用熒光能量轉(zhuǎn)移（FRET），形成單激光激發(fā)更多波長的發(fā)射光。

例如，Texas Red的激發(fā)為589 nm，而PE的發(fā)射為585 nm，因此通過將PE與Texas Red耦合，PE的發(fā)射光通過FRET激發(fā)Texas Red，從而使PE-TxRed可用488 nm或532 nm的激光器激發(fā)。

6、重金屬離子

重金屬離子嚴(yán)格說起來不算熒光素，但是我們也在此一起提一下。

7、熒光蛋白

熒光蛋白經(jīng)常用作基因表達(dá)的報告系統(tǒng)。常用的是來自維多利亞水母（Aequorea victoria）的綠色熒光蛋白（GFP）。由此衍生出CFP和YFP。

紅色熒光蛋白（DsRed）來自蘑菇�？�Discosoma，從DsRed衍生出下一代單體熒光蛋白（mCherry，mBanana），并具有更寬的激發(fā)和發(fā)射光譜。

隨著基因克隆技術(shù)的成熟，目前熒光蛋白已有數(shù)百種，其激發(fā)和發(fā)射光譜范圍從紫外線到近紅外。

8、核酸染料

核酸染料結(jié)合DNA、RNA或兩者均結(jié)合。它們可用于定量DNA進(jìn)行細(xì)胞周期分析（如PI，7-AAD，DyeCycle Violet，DAPI），分選染色體（如Hoescht 33342， Chromomycin A3），利用側(cè)群分析對干細(xì)胞進(jìn)行分選（如Hoescht 33342），。

將核酸染料與另一種標(biāo)記物（例如熒光染料偶聯(lián)的抗溴脫氧尿苷（BrdU））結(jié)合使用，能確定增殖水平。

9、細(xì)胞增殖染料

用BrdU（溴脫氧尿嘧啶核苷）孵育細(xì)胞，使其摻入細(xì)胞DNA合成過程，然后用針對BrdU的抗體和DNA染料染色，便可測量細(xì)胞增殖。但是，此方法不適合長期增殖研究。

10、細(xì)胞染料

細(xì)胞活力可以通過排除性染料（如碘化丙啶、DAPI）確定，也可通過染料與細(xì)胞內(nèi)胺類物質(zhì)的結(jié)合檢測。

排除性染料不能固定，僅適用于無感染性且需立即分析的細(xì)胞。

11、鈣指示劑染料

鈣指示劑染料與鈣結(jié)合后會發(fā)生色移，可用于指示細(xì)胞激活和信號傳導(dǎo)。

常用的染料仍然是indo-1，即紫外雙相鈣探針。另外還有fluo-3的Blue-green calcium probes。

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