熒光分子探針（Fluorescentprobe）是指利用熒光信號(hào)對(duì)被分析物進(jìn)行識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)被分析物定性或定量分析的一類分子。熒光分子探針通常包括三部分：熒光基團(tuán)（Fluorophore）、連接基團(tuán)（Spacer）、識(shí)別基團(tuán)（Receptor）（圖1）。其中，熒光基團(tuán)是指探針識(shí)別基團(tuán)與被分析物作用后將熒光信號(hào)輸出的部分。通常好的熒光基團(tuán)需具備以下幾點(diǎn)：較高的熒光量子產(chǎn)率，較大的斯托克斯位移，發(fā)射光譜位于長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)。連接基團(tuán)是指熒光基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)之間起到連接作用的部分。值得注意的是，有的探針并沒(méi)有明顯的連接基團(tuán)。而識(shí)別基團(tuán)是指與被分析物作用的部分，通常會(huì)與被分析物結(jié)合或進(jìn)行一定的化學(xué)作用，如氫鍵、配位鍵、化學(xué)反應(yīng)、靜電作用等，這些化學(xué)作用是引發(fā)熒光基團(tuán)信號(hào)變化的開(kāi)關(guān)。

熒光分子探針的響應(yīng)機(jī)理在文獻(xiàn)中主要包括以下五種，下面詳細(xì)介紹了五種熒光分子探針的特性

一、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理（Photo-inducedelectrontransfer，PET）

二、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理（Intramolecularchargetransfer，ICT）

三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理（Fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）

四、激發(fā)態(tài)-基態(tài)締合物/復(fù)合物機(jī)理（Excimer/Exciplex，Ex/Ex）

五、聚集誘導(dǎo)熒光機(jī)理（AggregationInducedEmission，AIE）

?光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理（PET）

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理是設(shè)計(jì)熒光分子探針常用的響應(yīng)機(jī)理，它可以分為a-PET型與d-PET型。其中，**的a-PET熒光分子探針是由給電子的受體（Receptor）通過(guò)連接基團(tuán)與熒光團(tuán)（Fluorophore）連接而成，由于識(shí)別基團(tuán)的HOMO軌道能級(jí)位于熒光團(tuán)HOMO與LUMO之間，當(dāng)a-PET熒光分子探針的熒光團(tuán)中較高占用軌道（HOMO）的電子受到激發(fā)，躍遷到分子較低未占用分子軌道（LUMO）時(shí)，識(shí)別基團(tuán)的HOMO軌道上的電子便能夠很輕易的能轉(zhuǎn)移到熒光團(tuán)的HOMO軌道上，從而導(dǎo)致熒光團(tuán)LUMO軌道上的電子回不到原來(lái)的HOMO軌道上，導(dǎo)致熒光發(fā)生了猝滅，這是所謂的a-PET（acceptor-excitedPET）（如圖2a）。然而當(dāng)待檢測(cè)分析物被加入后，識(shí)別基團(tuán)能夠與被分析物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使供電能力下降，其HOMO軌道比熒光團(tuán)的HOMO軌道低，從而導(dǎo)致PET過(guò)程受阻，熒光團(tuán)的熒光恢復(fù)（如圖2b）。而d-PET熒光分子探針是指識(shí)別基團(tuán)的LOMO軌道能級(jí)處于熒光團(tuán)的HOMO與LUMO之間，當(dāng)d-PET熒光分子探針的熒光團(tuán)中較高占用軌道（HOMO）的電子受到激發(fā)，躍遷到分子較低未占用分子軌道（LUMO）時(shí)，隨后轉(zhuǎn)入識(shí)別基團(tuán)的LUMO軌道，發(fā)生非輻射躍遷，導(dǎo)致熒光猝滅，即為d-PET（donor-excitedPET）（如圖2c）。然而當(dāng)加入分析物后，識(shí)別基團(tuán)與被分析物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，供電能力下降，其LOMO軌道升高，從而導(dǎo)致PET過(guò)程受阻，熒光團(tuán)的熒光恢復(fù)（如圖2b）。

圖2

?分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理（ICT）

熒光 ICT 效應(yīng)

什么是熒光 ICT 效應(yīng)
熒光ICT(Intramolecular Charge Transfer)效應(yīng)是一種分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，指的是當(dāng)一個(gè)分子中存在著兩個(gè)或多個(gè)不同電子親和力的基團(tuán)時(shí)，通過(guò)激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間的電荷轉(zhuǎn)移，使得分子在不同環(huán)境下呈現(xiàn)出不同的發(fā)射顏色。這種效應(yīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)、物理、生物學(xué)等領(lǐng)域，并被廣泛研究和利用。

光 ICT效應(yīng)的原理
熒光 ICT 效應(yīng)的原理可以通過(guò)以下步驟來(lái)解釋:
在分子的基態(tài)中，電子處于低能級(jí)軌道上。當(dāng)分子受到激發(fā)后，電子會(huì)躍遷1.
到高能級(jí)軌道上。
在高能級(jí)軌道上，分子中存在著兩個(gè)或多個(gè)不同電子親和力的基團(tuán)。這些基團(tuán)可以吸引或排斥電子。
當(dāng)電子躍遷到高能級(jí)軌道上時(shí)，它們會(huì)與這些基團(tuán)相互作用，并發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移。
通過(guò)電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程，分子內(nèi)部形成了一個(gè)帶正電荷和帶負(fù)電荷的極性結(jié)構(gòu)這種極性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了不同的發(fā)射顏色。

分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理（ICI）是另一種用于設(shè)計(jì)熒光分子探針常用的響應(yīng)機(jī)理（如圖3）。與PET機(jī)理不同的是，ICT是以熒光團(tuán)、供電子基團(tuán)（D）、吸電子基團(tuán)（A）三者通過(guò)共軛連接形成的電子推-拉體系為基礎(chǔ)的。當(dāng)用入射光對(duì)探針進(jìn)行照射時(shí)，分子內(nèi)的電子可以從電子給體向電子受體轉(zhuǎn)移，形成一個(gè)電荷分離穩(wěn)態(tài)。而探針的識(shí)別基團(tuán)與被分析物發(fā)生作用后，會(huì)改變電荷分離的程度，從而形成新的電子推-拉體系，改變熒光信號(hào)。通常，羥基、氨基等構(gòu)成ICT類熒光分子探針的供電子基團(tuán)，醛基、硝基、苯并噻唑等構(gòu)成拉電子基團(tuán)，它們通過(guò)共軛π鍵連接，當(dāng)供電子基團(tuán)的供電子能力增強(qiáng)或拉電子基團(tuán)的拉電子能力增強(qiáng)時(shí)，探針的吸收光譜、發(fā)射光譜紅移，這是因?yàn)闊晒夥肿犹结樀?/span>HOMO/LUMO能級(jí)差變小導(dǎo)致的。反之，熒光分子探針的HOMO/LUMO能級(jí)差變大，導(dǎo)致探針的吸收和發(fā)射光譜藍(lán)移。

圖3

?熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理（FRET）

熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理（Fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）是構(gòu)建比率型熒光探針一種常用的形式[11]。能量供體（Donor）和能量受體（Acceptor）兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)構(gòu)成熒光分子探針。隨著被分析物的加入，探針發(fā)生兩個(gè)不同發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化。通常，能量供體發(fā)射光譜和能量受體吸收光譜之間存在一定程度重疊，且兩者需要滿足一定距離時(shí)（一般小于10nm），FRET機(jī)理才能發(fā)生。用激光照射能量供體時(shí)，熒光能量從能量供體向受體轉(zhuǎn)移發(fā)生非輻射過(guò)程，產(chǎn)生受體熒光。影響熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率包括：能量供體的發(fā)射光譜與能量受體的吸收光譜重疊程度（一般大于30%）、能量供體與能量受體之間的距離（在1-10nm之間）、兩者躍遷偶極的相對(duì)取向。

圖4

?激發(fā)態(tài)-基態(tài)締合物/復(fù)合物機(jī)理（Excimer/Exciplex）

激發(fā)態(tài)-基態(tài)締合物/復(fù)合物是指兩個(gè)相同熒光基團(tuán)的聚集體或不同熒光基團(tuán)的聚集體。當(dāng)兩個(gè)相同的熒光基團(tuán)的距離相對(duì)接近時(shí)，其中一個(gè)熒光基團(tuán)受到光的激發(fā)，從基態(tài)到激發(fā)態(tài)，與另外一個(gè)基態(tài)的熒光基團(tuán)相互作用，激發(fā)態(tài)熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，形成激基締合物（Excimer）。單個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜被激基締合物的熒光發(fā)射光譜取代，形成一個(gè)新的熒光發(fā)射峰，具有強(qiáng)而寬，長(zhǎng)波長(zhǎng)，無(wú)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)不同時(shí)，則稱為激基復(fù)合物（exciplex）。激發(fā)態(tài)-基態(tài)締合物/復(fù)合物的形成需要具備一定的條件，**，距離是形成激基締合物/復(fù)合物的關(guān)鍵，兩個(gè)熒光基團(tuán)的距離一般應(yīng)該在3.5?以內(nèi)。其次，熒光基團(tuán)的電子云之間具有一定的重疊。熒光探針與被分析物作用后，導(dǎo)致熒光信號(hào)的變化（這是由于兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的距離發(fā)生變化）從而實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的檢測(cè)

圖5

?聚集誘導(dǎo)熒光機(jī)理（AIE）

2001年，發(fā)現(xiàn)硅雜環(huán)戊二烯（silole）衍生物在溶液狀態(tài)時(shí)幾乎不發(fā)光，而在形成固體或聚集態(tài)時(shí)熒光反而大大增強(qiáng)的現(xiàn)象，將此現(xiàn)象定義為聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)（AggregationInducedEmission，AIE）

聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)由于分子處于聚集態(tài)時(shí)排列整齊，分子間的規(guī)整度以及相互作用均增加，導(dǎo)致非輻射的能量轉(zhuǎn)移降低，導(dǎo)致聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)現(xiàn)象的產(chǎn)生。AIE型熒光分子探針的檢測(cè)過(guò)程是通過(guò)與被分析物反應(yīng)，導(dǎo)致探針?lè)肿拥木奂�或解離，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)改變而實(shí)現(xiàn)的[6]。具有AIE性質(zhì)的化合物從根本上克服了聚集導(dǎo)致熒光猝滅的難題，引起了研究學(xué)者的研究興趣，到目前為止，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了從藍(lán)光到紅光覆蓋整個(gè)可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍的AIE體系

圖6

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BCECF AM (pH熒光探針, 5mM)

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Fluo-4, Pentapotassium Salt|鈣離子熒光探針Fluo-4, 五鉀鹽

Fluo-4 AM|CAS 273221-67-3|鈣離子熒光探針Fluo-4, 五乙酰氧基甲酯

Fluo-3, pentasodium salt|鈣離子熒光探針Fluo-3, 五鈉鹽

Fluo-3, pentaammonium salt|鈣離子熒光探針Fluo-3, 五銨鹽

Fluo-3, pentapotassium salt|鈣離子熒光探針Fluo-3, 五鉀鹽

Fluo-3, AM/UltraPure grade/CAS121714-22-5/鈣離子熒光探針Fluo-3, 五乙酰氧基甲酯

Fluo-2, potassium salt|鈣離子熒光探針Fluo-2, 鉀鹽

Fluo-2, AM|CAS108964-32-5|鈣離子熒光探針

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