單克隆抗體的基本概念、原理、制備工藝和應(yīng)用

　　1.單克隆抗體的基本概念。

　　單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均勻，僅針對(duì)特定抗原位置的抗體稱為單克隆抗體。雜交瘤(hybridoma)抗體技術(shù)通常在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有特異性抗體分泌能力的致敏性B細(xì)胞和具有增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融入B細(xì)胞雜交瘤。通過將具有這一特征的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞群，可以為抗原位置制備特異性抗體，即單克隆抗體。

　　2.單克隆抗體技術(shù)的基本原理。

　　為了制備單克隆抗體，**需要獲得可合成抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細(xì)胞可以在體外生長和增殖。骨髓瘤細(xì)胞與免疫淋巴細(xì)胞相結(jié)合，通過細(xì)胞雜交技術(shù)獲得雜種骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承了兩種代際細(xì)胞的特征。它不僅具有B淋巴細(xì)胞合成抗體的特征，而且具有體外骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖的特征。單克隆抗體可由單個(gè)融合細(xì)胞的細(xì)胞組制備。其制備原理如下：

　　3.單克隆抗體制備的基本工藝。

　　(1)免疫動(dòng)物。

　　免疫動(dòng)物是利用抗原免疫小鼠產(chǎn)生致敏性B淋巴細(xì)胞的過程。一般來說，根據(jù)預(yù)先制定的免疫計(jì)劃，選擇6-8周齡的雌性Balb/C小鼠進(jìn)行免疫注射。抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞克隆、激活、增殖和分化為致敏性B淋巴細(xì)胞。

　　(2)細(xì)胞融合。

　　用眼球切除放血法殺死小鼠，無菌手術(shù)去除脾臟，擠壓平容器，制備脾細(xì)胞懸浮液。將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并添加聚乙二醇。在聚乙二醇的作用下，淋巴細(xì)胞可以融合成雜交瘤細(xì)胞。

　　(3)選擇性培訓(xùn)。

　　選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，通常使用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，由于缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，未融合的骨髓瘤細(xì)胞無法通過補(bǔ)救方法合成DNA而死亡。雖然未融合的淋巴細(xì)胞包括黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但它們不能在體外長期存活并逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能在HAT培養(yǎng)基中生存和增殖，因?yàn)樗鼈儚钠⒓?xì)胞中獲得次黃嘌呤類嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，具有骨髓瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。

　　(4)雜交瘤陽性克隆篩查克隆。

　　只有少數(shù)生長在HAT培養(yǎng)基中的雜交瘤細(xì)胞是分泌預(yù)定單克隆抗體的細(xì)胞。因此，必須進(jìn)行篩查和克隆。雜交瘤細(xì)胞的克隆培養(yǎng)通常采用有限稀釋法。陽性雜交瘤細(xì)胞可以通過免疫學(xué)篩選出能夠產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。確定單克隆抗體分泌的免疫球蛋白類型、亞類、特異性和親和力后，應(yīng)及時(shí)冷凍。

　　(5)制備單克隆抗體。

　　大量單克隆抗體主要采用動(dòng)物內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法：

　�、袤w內(nèi)誘導(dǎo)法采用Balb/c小鼠，先在腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，雜交瘤細(xì)胞在腹腔接種。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。大約1-2周后，你可以看到小鼠腹部擴(kuò)張。用注射器提取腹水，獲得單克隆抗體。

　�、隗w外培養(yǎng)方法將雜交瘤細(xì)胞放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集和培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，獲得所需的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來，新的培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，增加了抗體的產(chǎn)量。雜交瘤細(xì)胞應(yīng)在使用前進(jìn)行篩選。雜交瘤細(xì)胞有兩種：一種是篩選雜交瘤細(xì)胞;另一種是篩選雜交瘤細(xì)胞，它們可以在初選雜交瘤細(xì)胞中產(chǎn)生特異性抗體。這兩種篩選方法和原理不同。

　　4.單克隆抗體制備的應(yīng)用。

　　生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)具有醫(yī)學(xué)價(jià)值，可用于制備單克隆抗體：

　　(1)凝集實(shí)驗(yàn):haemaglutination。

　　(2)沉淀反應(yīng):Precipitationreaction。

　　(3)ELISA等免疫學(xué)檢測。

　　(4)親和分析:分離蛋白質(zhì)。

　　(5)免疫印記(westernbloting)

　　(6)免疫沉淀。

　　(7)BIAcorebiosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白質(zhì)的親和力。

　　(8)通過放射免疫學(xué)檢測免疫復(fù)合物。

　　(9)磁珠分離細(xì)胞。

　　(10)流式細(xì)胞儀:用于細(xì)胞分型和細(xì)胞分離。

　　(11)臨床疾病的診斷和**。