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          抗體的熒光標(biāo)記之異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗體的方法介紹
          發(fā)布時(shí)間:2020-09-16     作者:zhn   分享到:
          什么是抗體熒光標(biāo)記?

          將特異性抗體與熒光色素通過化學(xué)方法結(jié)合起來,即可得到熒光抗體。這種熒光抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合,形成熒光標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物,再通過特定的儀器檢測(cè)熒光,從而對(duì)抗原抗體進(jìn)行示蹤檢測(cè)。目前,熒光抗體因其高靈敏度、高特異性、易操作性被廣泛用于流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫吸附、蛋白印記、原位雜交、熒光成像等檢測(cè)中。

          熒光素:能夠產(chǎn)生明顯熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物稱為熒光素或熒光染料。適用于標(biāo)記蛋白的熒光色素主要有異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC),四乙基羅達(dá)明(rho-damine B200,RB200)和四甲基異硫氰基羅達(dá)明(tetramethyl rhodamine isotheynate,TMRITC)。實(shí)際上目前應(yīng)用比較多的只有異硫氰酸熒光素一種。

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          下面我們就以異硫氰酸熒光素(FITC)為例,簡(jiǎn)要介紹一下抗體的熒光素標(biāo)記方法。

          1.基本原理

          許多蛋白質(zhì)表面含有較多的賴氨酸殘基,這些賴氨酸殘基的游離ε-氨基可與FITC共價(jià)結(jié)合。與FITC結(jié)合的抗體可用為特異性的探針,以測(cè)定細(xì)胞相應(yīng)抗原的存在。FITC具有很高的量子產(chǎn)量(發(fā)射光與吸收光的比值為0 .85),而且形成的偶聯(lián)物的穩(wěn)定性很好,F(xiàn)ITC是目前應(yīng)用比較廣的熒光染料。在pH 9.8條件下,賴氨酸殘基的游離ε-氨基與FITC發(fā)生的親核反應(yīng),由此形成硫脲連接。


          2.標(biāo)記方法

          異硫氰酸熒光素常用的標(biāo)記法有以下兩種:

          1)攪拌法(適合大樣品)

          • 取一定量的純化后的IgG溶液,用0.5 mol/L pH9.8碳酸鹽緩沖液稀釋至20 mg/mL。

          • 按熒光素與抗體比1︰20~1︰100(一般用1︰100)稱取異硫氰酸熒光素,用pH9.8碳酸鹽緩沖液溶解。

          • 將IgG溶液置于電磁攪拌器上,啟動(dòng)開關(guān),輕輕攪拌,以不起沫為準(zhǔn)。逐滴加入熒光素液(約10min~15min加完)。實(shí)驗(yàn)過程中,隨時(shí)測(cè)定攪拌液的pH值,若低于9.0,則應(yīng)以碳酸鈉溶液調(diào)整。置4 ℃攪拌6 h~12 h即可。

          2)透析法(適合小樣品)

          • IgG溶液用0.5 mol/L pH9.8碳酸鹽緩沖液稀釋成1%濃度,裝入透析袋中。

          • 將熒光素配成0.1 mg/mL,其量為1%抗體溶液的10倍,裝入燒杯中。

          • 將透析袋置于燒杯中,放電磁攪拌器上4 ℃攪拌24即可。

          透析法的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記均勻,非特異性熒光少,但所標(biāo)記的時(shí)間長(zhǎng),熒光素的用量多,約比攪拌法多10倍。


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