雜交瘤技術(shù)(hybridoma technique)是將骨髓瘤細(xì)胞和免疫B淋巴細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞。這種雜交細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的遺傳特性，既能象B淋巴細(xì)胞一樣分泌抗體，又能像骨髓瘤細(xì)胞一樣無(wú)限增殖，從而成了分泌抗體的“永生細(xì)胞”。與傳統(tǒng)的免疫動(dòng)物方法制備抗體相比，利用雜交瘤技術(shù)可以制備出高純度的單抗，并且可以進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)。

與傳統(tǒng)的免疫動(dòng)物方法制備抗體相比，利用雜交瘤技術(shù)可以制備出高純度的單抗，并且可以進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)。

雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體過(guò)程中的篩選方法與意義

一次篩選

細(xì)胞融合后，雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)是篩選的關(guān)鍵。普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)液是在普通的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。其依據(jù)是細(xì)胞中的DNA合成有兩條途徑：生物合成途徑(“D途徑”)和應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑(“S途徑”)。在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)B細(xì)胞和兩個(gè)效應(yīng)B細(xì)胞融合的“D途徑”被氨基喋呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力，一般10d左右。

對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤—鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶缺陷型(HGPRT)細(xì)胞，因此自身沒(méi)有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。唯有骨髓瘤細(xì)胞與效應(yīng)B細(xì)胞相互融合形成的雜交瘤細(xì)胞，既具應(yīng)B細(xì)胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長(zhǎng)期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來(lái)，并不斷增殖。

2.二次篩選

在實(shí)際免疫過(guò)程中，由于采用連續(xù)注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機(jī)體形成相對(duì)應(yīng)的一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對(duì)某一預(yù)定抗原快定簇的特異性雜交瘤細(xì)胞。通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋?zhuān)�接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每一孔含一個(gè)或幾個(gè)雜交瘤細(xì)胞(理論上30%的孔中細(xì)胞數(shù)為0時(shí)，才能有些孔中是單個(gè)細(xì)胞)，再由這些單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。