螢火蟲熒光素酶是一個(gè)61kDa單亞基蛋白質(zhì),酶活性不需翻譯后修飾(3,4)。因此，一旦翻譯完成即具有遺傳報(bào)告基因的功能。在ATP,Mg和 O存在下，通過(guò)甲蟲熒光素的氧化反應(yīng)放出光子(圖1)。在傳統(tǒng)反應(yīng)條件下，熒光素的氧化要經(jīng)過(guò)一個(gè)熒光素-AMP中間體，轉(zhuǎn)換非常緩慢。結(jié)果，這種檢測(cè)化學(xué)在底物和酶混合后產(chǎn)生一種"閃爍"光，并迅速衰減�，F(xiàn)在，普洛麥格公司在獲得專利的定量檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性的試劑中加入了輔酶A(CoA)，通過(guò)加快酶轉(zhuǎn)換(5)提供改進(jìn)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，從而得到延長(zhǎng)的"輝光"熒光信號(hào)(圖2)。

海腎熒光素酶是一個(gè)36 kDa單亞基蛋白質(zhì)，純化自自然界來(lái)源的Renilla reniformis"%) ,含有3%的碳水化合物。如同螢火蟲熒光素酶，海腎熒光素酶的活性也不需要翻譯后修飾，一旦翻譯完成即可行使遺傳報(bào)告基因的功能。海腎熒光素酶利用Oz和腔腸熒光素(coelenterazine)催化發(fā)光反應(yīng)(圖1)。當(dāng)應(yīng)用DLR檢測(cè)化學(xué)操作時(shí)，海腎熒光素酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生輝光型熒光信號(hào)，并在測(cè)量過(guò)程中緩慢地衰減(圖2)。

圖1．由螢火蟲和海腎熒光素酶所催化的生物發(fā)光反應(yīng)

圖⒉用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到的螢火蟲和海腎熒光素酶產(chǎn)生的熒光。

在DLR檢測(cè)系統(tǒng)中，螢火蟲和海腎熒光素酶的活性是從同一裂解液中分步測(cè)量的。在完成螢火蟲熒光素酶活性("實(shí)驗(yàn)"報(bào)告基因)的測(cè)量后，螢火蟲熒光被快速淬滅，并在這同時(shí)激活海腎熒光素酶的熒光反應(yīng)("對(duì)照”報(bào)告基因的活性)。因此，DLR檢測(cè)系統(tǒng)綜合了兩個(gè)檢測(cè)化學(xué)，對(duì)來(lái)自轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液或無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中共同表達(dá)的兩個(gè)報(bào)告基因快速地提供定量結(jié)果。

螢火蟲熒光素酶檢測(cè)的線性范圍延伸達(dá)酶濃度的8個(gè)數(shù)量級(jí),可檢測(cè)≤lfg(大約10摩爾)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因酶(圖3A)。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，海腎熒光素酶的線性范圍達(dá)酶濃度的7個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)照?qǐng)?bào)告基因酶檢測(cè)的底限≤10fg(大約3×101摩爾)(圖3B)。此外，這兩個(gè)酶表現(xiàn)的特異性活性相似。

用pGL3 -Control和pRL-SV40載體DNA共同轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(1×10°個(gè)細(xì)胞/60mm培養(yǎng)).細(xì)胞用PBS洗滌后,加入400ul的 PLB并刮下細(xì)胞，制成裂解液。分出 20ul 的細(xì)胞裂解液，并將其和100ul的熒光素酶檢測(cè)試劑II(LARII)混合，立即用熒光發(fā)光計(jì)測(cè)量螢火蟲熒光素酶的活性(綠線)。然后，在熒光發(fā)光計(jì)試管中加入100ul的 Stop &GloTM試劑，以淬滅螢火蟲熒光素酶反應(yīng)，同時(shí)激活海腎熒光素酶反應(yīng)，并立即測(cè)量海腎熒光素酶的活性(藍(lán)線)。此實(shí)驗(yàn)使用Turner Designs型號(hào)20e熒光發(fā)光計(jì),配合一臺(tái)計(jì)算機(jī)來(lái)示蹤在12秒鐘檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)的熒光發(fā)射情況。

圖3.螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶發(fā)光反應(yīng)的線性范圍。

純化的螢火蟲和海腎熒光素酶經(jīng)含有1mg/ml BSA的1xPLB緩沖液連續(xù)稀釋。使用配有計(jì)算機(jī)的Turner Designs 熒光發(fā)光計(jì)20e型，在經(jīng)過(guò)一個(gè)初始2秒的預(yù)讀延遲后，確定兩種熒光素酶在各種不同濃度時(shí)，在10秒鐘內(nèi)的總熒光。

圖4.用手動(dòng)操作的熒光發(fā)光計(jì)，或配有一支試劑進(jìn)樣器的熒光發(fā)光計(jì)進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)的方法。

如果熒光發(fā)光計(jì)配有兩個(gè)進(jìn)樣器，則將裂解的樣品預(yù)先分裝到熒光發(fā)光計(jì)的試管中，隨后按次序自動(dòng)加入LuciferaseAssay Reagent II(LAR I)和 Stop & GloTM試劑。

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