FITC-D-Lys 合成步驟詳解

一、反應(yīng)原理

異硫氰酸熒光素（FITC）的異硫氰酸酯基（-NCS）與 D-賴氨酸的 ε-氨基（-NH?）在堿性介質(zhì)中發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成穩(wěn)定的硫脲鍵（-NH-CS-NH-），生成 FITC-D-Lys 熒光衍生物。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

原料準(zhǔn)備?

FITC 溶液配制?：將 FITC（1-5 mg/mL）溶解于無水 DMSO 中，避光保存。

D-賴氨酸溶液配制?：將 D-賴氨酸溶解于 0.1 M 碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.5）中，確保氨基處于去質(zhì)子化活性狀態(tài)。

偶聯(lián)反應(yīng)?

在避光條件下，將 FITC 溶液緩慢滴加至 D-賴氨酸溶液中，控制 ?FITC/D-賴氨酸摩爾比? 為 1:1 至 1:2（根據(jù)標(biāo)記密度需求調(diào)整）。

室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng) ?1-2 小時?，通過 ?pH 維持 8.5? 確保反應(yīng)高效進(jìn)行。

反應(yīng)終止與純化?

終止反應(yīng)?：通過超濾離心或透析（截留分子量 3.5 kDa）去除未反應(yīng)的游離 FITC。

初級純化?：凝膠過濾層析（Sephadex G-25 柱），分離 FITC-D-Lys 與未偶聯(lián)的小分子雜質(zhì)。

二級純化?：反相高效液相色譜（HPLC，C18 柱），流動相為甲醇-水梯度體系，收集目標(biāo)產(chǎn)物峰。

三、質(zhì)量控制與保存

純度檢測?：通過 HPLC 分析純度（≥95%）及質(zhì)譜驗(yàn)證分子量。

儲存條件?：產(chǎn)物凍干后于 -20℃ 避光保存，避免反復(fù)凍融；溶解時優(yōu)先使用 DMSO 或 PBS（pH 7.4）。

關(guān)鍵參數(shù)與優(yōu)化建議

參數(shù) 設(shè)置范圍 優(yōu)化目標(biāo)

pH? 8.0-9.0（堿性緩沖液） 提升 FITC 反應(yīng)活性

摩爾比? FITC=1:1-1:2 平衡標(biāo)記效率與成本

反應(yīng)時間? 1-2 小時 避免 FITC 水解副反應(yīng)

注意事項(xiàng)

避光操作?：FITC 對光敏感，全程需在棕色玻璃器皿或遮光條件下進(jìn)行。

溶劑選擇?：避免使用含伯胺試劑（如 Tris 緩沖液），以防競爭性反應(yīng)干擾。

生物相容性測試?：若用于活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，需驗(yàn)證終產(chǎn)物的細(xì)胞毒性（如 CCK-8 法）。

通過上述步驟，可高效合成高純度 FITC-D-Lys，滿足蛋白質(zhì)標(biāo)記、細(xì)菌成像等多種研究需求。

以上資料由小編zhn提供，僅用于科研

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