FITC-D-Lys在細胞成像中如何使用？

一、樣品制備與標記流程

探針溶解與濃度控制?

溶解試劑?：推薦使用無血清培養(yǎng)基或 PBS（pH 7.4）溶解 FITC-D-Lys，濃度范圍為 ?5-20 μM?（根據(jù)細胞類型調(diào)整）。

DMSO 輔助溶解?：若溶解困難，可先用 DMSO 溶解（終濃度 ≤1%），避免影響細胞活性。

細胞孵育與標記?

孵育條件?：將細胞與 FITC-D-Lys 孵育（37℃，5% CO?），時間通常為 ?30 分鐘至 2 小時?，具體需優(yōu)化以平衡穿透效率與背景信號。

洗滌步驟?：孵育后，用預(yù)冷的 PBS 洗滌 3 次，去除未結(jié)合的探針。

二、成像參數(shù)與設(shè)備設(shè)置

熒光顯微鏡參數(shù)?

激發(fā)波長?：488 nm（常用激光或汞燈激發(fā)）。

發(fā)射波長?：520-535 nm（綠色熒光通道）。

曝光時間?：控制在 100-500 ms，避免光漂白。

共定位分析（可選）?

與其他細胞器染料（如 LysoTracker Red 標記溶酶體）共染色，驗證 FITC-D-Lys 的細胞內(nèi)定位。

使用共聚焦顯微鏡 Z-stack 掃描獲取三維成像數(shù)據(jù)。

三、應(yīng)用場景與實驗優(yōu)化

應(yīng)用方向? ?實驗策略?

受體介導(dǎo)的細胞攝取? 通過 LAT1 轉(zhuǎn)運體（如腫瘤細胞、血腦屏障內(nèi)皮細胞）研究 D-賴氨酸的主動轉(zhuǎn)運機制。

代謝動態(tài)追蹤? 延時成像記錄 FITC-D-Lys 在胞內(nèi)的分布變化，分析代謝動力學(xué)。

細菌細胞壁標記? 將 FITC-D-Lys 整合至革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）的肽聚糖層，觀察分裂位點。

四、注意事項與優(yōu)化建議

背景信號控制?

設(shè)置未標記細胞的空白對照，排除自體熒光干擾。

使用含 0.1% BSA 的洗滌液減少非特異性吸附。

活性驗證?

通過 CCK-8 或 Calcein-AM 法評估探針對細胞活性的影響。

避免過量標記（建議 FITC/D-Lys 摩爾比 ≤1:15），防止聚集導(dǎo)致熒光猝滅。

儲存與穩(wěn)定性?

標記后的細胞樣品需避光保存，建議成像前 24 小時內(nèi)完成標記。

FITC-D-Lys 凍干粉長期保存于 -20℃，避免反復(fù)凍融。

典型實驗結(jié)果示例

癌細胞成像?：FITC-D-Lys 在 HeLa 細胞中呈點狀分布，與溶酶體共定位（pH 敏感性驗證）。

細菌追蹤?：標記后的金黃色葡萄球菌在分裂期顯示環(huán)形熒光信號，輔助研究細胞壁合成機制。

通過上述方法，FITC-D-Lys 可作為高效工具研究細胞代謝、病原體感染及藥物遞送機制。