熒光標(biāo)記氨基酸定制技術(shù)
一、概述
氨基酸的熒光標(biāo)記廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)追蹤、代謝示蹤、酶活分析、信號(hào)路徑研究等。通過對(duì)天然氨基酸或其衍生物進(jìn)行熒光修飾,可構(gòu)建熒光探針、標(biāo)記底物或模擬肽鏈。
二、定制技術(shù)流程
1. 氨基酸前體選擇
天然氨基酸如:Lys(有–NH?)、Cys(有–SH)、Asp/Glu(有–COOH)
衍生化氨基酸(Fmoc-AAs、Boc-AAs等)
2. 熒光染料與連接方式
FITC → 反應(yīng)Lys上的–NH?
NHS-Rhodamine/Cy5 → 胺基偶聯(lián)
Maleimide類熒光染料 → 與Cys-SH反應(yīng)
EDC/NHS法 → 用于氨基與羧基之間的偶聯(lián)
3. 反應(yīng)條件
水或DMF體系反應(yīng)
pH控制在 7.4–8.5 之間
反應(yīng)時(shí)間:1~12小時(shí),避光
4. 純化與分析
純化方式:透析、HPLC、層析
分析方法:MALDI-TOF、熒光光譜、NMR、MS
三、應(yīng)用
熒光氨基酸用于體內(nèi)代謝示蹤
熒光氨基酸修飾多肽構(gòu)建FRET探針
蛋白質(zhì)定向修飾或活性檢測(cè)
四、推薦試劑
試劑 | 功能 |
FITC、NHS-Cy5 | 主流熒光標(biāo)記物 |
L-Lysine、Cys、Fmoc-Lys(Boc)-OH | 常用氨基酸底物 |
DMF、HEPES | 溶劑體系 |
EDC、NHS | 酰胺鍵催化劑 |
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